Disturbo dello spettro alcolico fetale: è una ciliopatia?

Sfondo: Il termine "disturbo dello spettro alcolico fetale" (FASD) descrive un ampio spettro di presentazioni dello sviluppo neurologico derivanti dall'esposizione all'alcol in utero. La prevalenza è stata stimata in 1 persona su 100 e stimata in oltre 330.000 individui affetti in Canada. Le linee guida diagnostiche canadesi descrivono gli effetti fisici e sullo sviluppo neurologico derivanti dall'esposizione prenatale all'alcol. Questi includono caratteristiche facciali distinte, microcefalia e deficit dello sviluppo neurologico.

La tossicità dell'etanolo è studiata in associazione alla concentrazione, alla durata e ai tempi dell'esposizione all'etanolo e ai possibili percorsi che portano alla traduzione fenotipica alla teratogenesi. Gli studi sul FASD nei modelli animali stanno iniziando a coinvolgere un numero di geni di suscettibilità che sono coinvolti in vari percorsi molecolari sulle interazioni gene-etanolo. Secondo quanto riferito, alcuni dei quali sono coinvolti nella teratogenesi dell'etanolo come parte dei loro ruoli nel controllo del danno al DNA, nella formazione dell'asse del sistema nervoso centrale, nella sopravvivenza cellulare, nonché nella proliferazione e nella crescita.

È noto che una mutazione in un particolare gene, l'ossido nitrico sintasi neuronale (nNOS) peggiora la morte neuronale indotta dall'alcol sia in vivo che in vitro, e l'espressione del gene nNOS protegge i neuroni dalla tossicità dell'alcol L'ossido nitrico (NO) è sintetizzato dal enzima ossido nitrico sintasi (NOS attraverso) L-arginina Ci sono tre isoforme NOS: NOS neuronale (nNOS, NOS-1), NOS inducibile (iNOS, NOS-2) e NOS endoteliale (eNOS, NOS-3). associato alla modulazione della neurotrasmissione e alla formazione della memoria insieme ad altre attività vitali. In presenza di O2 si formano radicali che possono portare a tossicità. Possono essere dannosi per i processi di segnalazione cellulare e portare a condizioni patologiche.

I dati suggeriscono che l'etanolo altera l'espressione e l'attività di NOS nel cervello. Sono noti gli effetti dell'etanolo sulla produzione di NO, sulle attività di NOS e sulle interazioni di NO con gli enzimi del metabolismo dell'alcol.

La dose e la durata dell'esposizione all'etanolo sono i principali fattori che determinano gli effetti dell'etanolo sulla produzione di NOS, sull'attività NOS o sull'espressione di NOS.

Le anomalie cerebrali congenite strutturali sono descritte nel contesto della FASD, tra cui microcefalia, anomalie della migrazione, difetti del tubo neurale insieme ad anomalie cerebrali della linea mediana che coinvolgono il corpo calloso, anomalie cerebellari e idrocefalo.

Le ciglia sono organelli simili ad antenne evolutivamente conservati che si trovano sulla superficie delle cellule. Le ciglia rilevano diversi stimoli extracellulari come il flusso di liquidi, la luce, l'olfatto e gli ormoni attraverso specifici recettori ciliari e svolgono un ruolo chiave nella locomozione e divisione cellulare, nel movimento dei fluidi e nello sviluppo embrionale di diversi tessuti. Per quanto riguarda lo sviluppo neurale, è stato recentemente dimostrato che i fattori di crescita ciliare svolgono un ruolo nella migrazione e nella segnalazione delle cellule neuronali embrionali, nonché nella formazione della linea mediana e della lateralizzazione del sistema nervoso centrale (SNC). Nell'organismo maturo, le ciglia si estendono dai corpi basali delle cellule ependimali che rivestono la superficie ventricolare del cervello, dove facilitano il flusso del liquido cerebrospinale (CSF).

I difetti del sistema nervoso sono fortemente associati a una serie di ciliopatie, con reperti comuni che includono difetti della linea mediana come l'idrocefalo, difetti del tubo neurale e una pletora di anomalie corticali e cerebellari.

Il prototipo della malattia ciliare umana è stata la discinesia ciliare primaria (PCD). Nell'ultimo decennio, progressi significativi nella comprensione della PCD hanno portato a una migliore diagnosi, principalmente grazie alla scoperta che l'ossido nitrico nasale (NO nasale) è notevolmente ridotto in questi pazienti. È stato suggerito che il meccanismo di questa riduzione sia correlato alla ridotta espressione di iNOs come parte della ciliopatia. La misurazione dell'NO nasale è un semplice test non invasivo facilmente eseguibile anche nei pazienti più giovani.

Poiché la misurazione dell'NO è un semplice test non invasivo con risultati immediati, funge da test di screening ideale per la diagnosi suggestiva di varie ciliopatie, comprese quelle che coinvolgono malformazioni cerebrali.

In un lavoro recente, questo gruppo di ricerca è stato il primo a determinare una connessione tra la disfunzione ciliare misurata dalla concentrazione nasale di NO e le anomalie isolate del sistema nervoso centrale (SNC) della linea mediana Il livello medio complessivo di NO nasale nei bambini con anomalie isolate del SNC della linea mediana nello studio, era significativamente inferiore rispetto all'intervallo normale stabilito in precedenza, con alcuni all'interno dell'intervallo della discinesia ciliare primaria (PCD). Un lavoro recente mostra che la connettività inter neuronale, la morfogenesi dei ventricoli cerebrali e la corretta formazione del tubo neurale dipendono dalla funzione ciliare non interrotta.

La funzione primaria delle ciglia è il risultato di proteine ​​di membrana come policistina-1 (PC-1), PC-2, TRPV4, P2Y12 e fibrocistina. L'alfa tubulina acetilata è un noto marcatore ciliare.

Le alterazioni nel PC-1 sono associate a mutazioni del rene policistico di tipo 1 che sono risultate associate a difetti di ossidazione degli acidi grassi nei test metabolomici e lipidomici. L'alfa tubulina acetilata viene valutata mediante analisi proteinomica.

Ipotesi: dato il recente riconoscimento delle interazioni tra NO con etanolo e l'importante ruolo delle ciglia nello sviluppo precoce del cervello, i ricercatori ipotizzano che le ciglia possano essere coinvolte in percorsi molecolari che portano a lesioni cerebrali nei bambini a cui viene diagnosticata la FASD. Tale meccanismo non è stato precedentemente esplorato.

I ricercatori ipotizzano che i livelli nasali di NO così come i metaboliti chiave nei pazienti con diagnosi di FASD saranno ridotti rispetto ai controlli sani.

Obiettivo: questo studio mirerà a misurare l'NO nasale in un gruppo selezionato di pazienti con diagnosi di disturbo dello spettro alcolico fetale, insieme all'analisi metabolomica e proteinomica in relazione ai metaboliti chiave coinvolti nella via dell'NO nei campioni di urina e confrontarli con bambini sani. Questo studio consentirà ai medici di impiegare potenzialmente uno strumento di screening non invasivo per i pazienti pediatrici con sospetto disturbo dello spettro alcolico fetale e prendere in considerazione un intervento precoce sullo sviluppo.

Metodi: 10 bambini di età compresa tra 5 e 16 anni, a cui viene diagnosticata la FASD, saranno reclutati dalla clinica ambulatoriale FASD presso il Glenrose Rehabilitation Hospital. 10 bambini sani della stessa fascia di età saranno reclutati attraverso il registro HICUPP per bambini sani (Pro00056156).

Gli investigatori misureranno i livelli nasali di NO inserendo una linea di campionamento NO inerte con un'oliva monouso in schiuma (DirectMed Inc., Glen Cove, NY) nella narice del bambino mentre la narice controlaterale è lasciata aperta. L'aria verrà quindi campionata a una velocità costante di 0,3 litri/min dal naso da un analizzatore chemiluminescente che fornisce la misurazione del livello nasale di NO in parti per miliardo (ppb). Tutte le misurazioni di NO nasale verranno eseguite con i soggetti seduti.

Le misure saranno ottenute utilizzando un analizzatore di NO (CLD 88 SP, ECO PHYSICS AG, Duerten, Svizzera). L'analizzatore sarà calibrato secondo le specifiche del produttore. Le misurazioni verranno effettuate utilizzando la tecnica della chiusura velum tramite espirazione da una profonda inspirazione attraverso un resistore fisso (cilindro di cartone monouso con apertura da 1 mm; DirectMed Inc., Glen Cove, NY) per 20-40 secondi o tramite un giocattolo gonfiabile per bomboniere con una resistenza espiratoria paragonabile. Entrambi i tipi di resistenza richiedono un leggero soffio delle guance per sviluppare una pressione della bocca > 5 cm H2O, una pressione sufficiente a chiudere il palato molle. Le manovre saranno eseguite secondo le linee guida ATS/ERS. Nei pazienti che non collaborano con la manovra di cui sopra, le misurazioni verranno effettuate utilizzando il campionamento del respiro di marea.

L'esaminatore inserirà il livello di NO misurato direttamente in un file di computer, che verrà salvato in un formato crittografato su un computer protetto da password presso il Glenrose Rehabilitation Hospital. Non verranno inserite informazioni identificative come nomi o numeri di telefono dei partecipanti. Ad ogni partecipante verrà assegnato un numero anziché un nome, che verrà registrato. Anche altre informazioni identificative, come il sesso, l'età e la diagnosi del bambino, saranno codificate utilizzando un numero.

Sulla base delle informazioni fornite, verrà eseguita un'analisi statistica delle co-varianti, confrontando i livelli di NO misurati dei pazienti con FASD rispetto ai controlli sani (con l'intervallo di riferimento del normale come pubblicato in Mateo 2011 e Marthin 2011).

Oltre alle misurazioni nasali di NO, i ricercatori condurranno anche analisi metabolomiche e proteomiche per misurare i livelli di metaboliti e proteine ​​​​chiave nelle urine dei pazienti con FASD. Questi saranno confrontati con i controlli sani per esplorare ulteriormente questa ipotesi di coinvolgimento ciliare. Le analisi metabolomiche saranno utilizzate per misurare i metaboliti chiave coinvolti nella via dell'NO (arginina, citrullina, ornitina, dimetilarginina asimmetrica) così come i sottoprodotti solubili dell'NO (nitrotirosina, nitrotriptofano e acido 3-nitro-4-idrossifenilacetico). Saranno eseguiti ulteriori studi metabolomici per cercare marcatori di beta-ossidazione alterati (acilcarnitine) che possono essere influenzati da disfunzione ciliare, livelli vitaminici (esp. vitamina A e suoi sottoprodotti) così come i cambiamenti nelle catecolamine (a causa di funzioni neuronali alterate influenzate dalle ciglia) nelle urine. Le analisi metabolomiche saranno effettuate utilizzando metodi metabolomici mirati basati sulla SM. I ricercatori condurranno anche analisi proteomiche sull'urina nei pazienti con FASD per misurare i cambiamenti nelle proteine ​​ciliari chiave, vale a dire la policistina-1 (PC-1) (PC-2, TRPV4, P2Y12, fibrocistina) e l'alfa-tubulina acetilata e confrontare questi valori a un gruppo di bambini sani. Le analisi proteomiche consisteranno in una combinazione di proteomica basata su MS e immunodosaggi.

I dati saranno analizzati utilizzando PASW Statistics Versione 19 (SPSS Inc., 2010). Alpha sarà impostato a .05 per tutte le analisi. Verrà calcolata la percentuale di bambini che ottengono un punteggio superiore e inferiore all'età e ai valori limite basati sulla norma per ciascuna misurazione.

Per determinare se i due gruppi (FASD, controlli sani) differiscono nel livello misurato, verrà condotta un'analisi multivariata della varianza (MANOVA) sui punteggi delle sottoscale utilizzando il gruppo come fattore tra soggetti.

Notando che la dimensione del campione è piccola, i ricercatori riporteranno una dimensione dell'effetto tra i gruppi per il livello di NO e l'analisi metabolomica, nonché un intervallo di confidenza del 95% per la dimensione dell'effetto. L'ipotesi è che ci sia una differenza tra i gruppi; dato che gli investigatori non possono provare il nulla (cioè, la mancanza di un risultato statisticamente significativo non dimostrerà l'ipotesi), gli investigatori useranno questa dimensione dell'effetto per stimare invece l'effetto. Tuttavia si ipotizza che i livelli nasali di NO ei metaboliti chiave relativi all'NO nei bambini con FASD saranno ridotti rispetto ai controlli sani.

Dopo il completamento dello studio, i dati anonimi verranno conservati in un file crittografato sul computer protetto da password per un minimo di cinque anni.