Granzyme A in pazienti con infezioni del tratto urinario batterico da E. Coli (GABEC)

1. Ipotesi di ricerca

Il gruppo di ricerca ha esplorato il ruolo di GZM A

1. Ipotesi concettuale:

   • Granzyme A è un mediatore patogeno della sepsi.
   • I polimorfismi del gene Granzyme A determinano la concentrazione sierica di GZM A in pazienti con infezioni sistemiche.
   • I polimorfismi del gene Granzyme A determinano il rischio di sepsi nei pazienti con infezioni sistemiche.

2. Ipotesi operativa:

   • Tra i pazienti con batteriemia (E. coli) infezioni del tratto urinario (UTI), i livelli di GZM A sono significativamente più alti in quei pazienti che sviluppano sepsi rispetto a quelli che non sviluppano sepsi.

   • Ci sono differenze significative nel profilo del polimorfismo del gene GZM A dei pazienti con batteriemia (E. coli) infezioni delle vie urinarie che sviluppano sepsi rispetto a coloro che non sviluppano sepsi.

     2. Finalità e obiettivi

   • Obiettivi

     1. Per valutare il ruolo patogeno di GZM A nella sepsi in pazienti con batteriemia (E. coli) IVU.
     2. Per esplorare la capacità dei polimorfismi GZM A di anticipare il rischio di sviluppare sepsi in pazienti con batteriemia (E. coli) IVU.
     3. Per valutare la potenziale utilità di GZM A come biomarcatore diagnostico di sepsi in pazienti con batteriemia (E. coli) IVU.
     4. Caratterizzare il "viruloma" di E. coli tra i ceppi uropatogeni circolanti.

   • Obiettivi

     1. Per valutare la correlazione tra livelli sierici di GZM A e risposta infiammatoria sistemica in pazienti con batteriemia (E. coli) IVU.
     2. Per caratterizzare i polimorfismi del gene GZM A tra i pazienti con batteriemia (E. coli) IVU
     3. Per valutare la cinetica sierica di GZM A tra i pazienti con batteriemia (E. coli) IVU
     4. Caratterizzare fenotipicamente e molecolarmente i ceppi di E. coli che causano IVU batteriemiche, inclusi i loro fattori di virulenza ("viruloma").

     3. Risultati attesi.

   • Caratterizzazione del ruolo patogeno di GZM A nella sepsi in pazienti con infezioni sistemiche
   • Caratterizzazione di GZM A come biomarcatore di sepsi in un modello umano di infezione-sepsi.

   • Caratterizzazione fenotipica e molecolare di E. coli uropatogeni che causano infezioni del flusso sanguigno.

     4. Metodi

   4.1. Design e portata del progetto

   - Studio caso-controllo prospettico ed esplorativo da condurre presso un ospedale universitario (Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa) affiliato all'Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (IIS Aragón).

   4.2. Periodo di studio: giugno 2019 - dicembre 2020.

   4.3. Pazienti e dimensione del campione

   Criteri di inclusione (Per soddisfare tutti):

   • Età >= 18 anni.
   • Infezione del flusso sanguigno da E. coli

   • Fonte urinaria. La fonte urinaria dovrebbe essere considerata se (qualsiasi) dei seguenti:

     1. La fonte urinaria è sospettata clinicamente ed entrambi gli isolati di E. coli (nel sangue e nell'urinocoltura) condividono lo stesso fenotipo (antibiogramma).
     2. La fonte/origine urinaria è sospettata clinicamente e l'urinocoltura è negativa, ma il paziente aveva ricevuto almeno una dose di qualsiasi antibiotico sistemico con attività antimicrobica contro il ceppo di E. coli che causa la BSI prima che fossero ottenute le emocolture.
     3. Entrambi gli isolati (nel sangue e nell'urinocoltura) condividono lo stesso fenotipo (antibiogramma) e non esiste una fonte alternativa.

   Criteri di esclusione:

   1. Uso di antibiotici sistemici per >48h nei due mesi precedenti l'episodio.

   2. Ospiti immunocompromessi - Pazienti che ricevono uso sistemico di steroidi (>10 mg di prednisone/giorno per 10 o più giorni nei 2 mesi precedenti).

      • Pazienti sottoposti a terapia biologica (2 mesi precedenti).
      • Cancro attivo solido o ematologico.
      • HIV +.
      • Neutropenia < 500 PMN/microl.

   3. Anomalie del tratto urinario basale o microbioma vescicale modificato localmente (qualsiasi):

      - Ureteroileostomia, ureterosigmoidostomia, ureterostomia (Bricker) o nefrostomia.

      • Catetere urinario a permanenza (negli ultimi due mesi)
      • Chirurgia urologica (negli ultimi due mesi).
      • Chemioterapia intravescicale (negli ultimi due mesi).
      • Instillazione intravescicale di BCG (negli ultimi due mesi).

      I potenziali candidati saranno rilevati giornalmente dai microbiologi del gruppo di ricerca. I criteri di inclusione saranno verificati nell'incontro multidisciplinare che i team di stewardship antimicrobica (AST) conducono quotidianamente presso l'ospedale partecipante.

      Dimensione stimata della popolazione in studio. Corrispondenza:

      - Saranno inclusi 50 pazienti con un rapporto sepsi/non sepsi 1:1.

      - I pazienti settici e non settici saranno abbinati per sesso, età (+/- 10 anni), comorbidità (punteggio di Charlson +/-1), tempo di insorgenza dei sintomi all'emocoltura (+/- 24 ore)

      4.4. Definizioni

      Casi (sepsi/shock settico):

      - La sepsi o lo shock settico sono definiti come disfunzioni d'organo pericolose per la vita causate da una risposta dell'ospite disregolata all'infezione secondo la SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definition Conference del 2001.

      Controlli:

      - Assenza di sepsi o shock settico secondo la Conferenza internazionale sulla definizione della sepsi del 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      4.5. Variabili

      4.5.1. Variabili correlate al paziente:

      - Dati demografici: sesso, età.

      • Comorbidità: Indice di Charlson modificato
      • Creatinina sierica al basale.

      4.5.2. Variabili correlate all'infezione.

      - Tempo dalla comparsa dei sintomi all'inizio del trattamento antimicrobico.

      - Tempo dall'insorgenza dei sintomi all'inizio del trattamento antimicrobico appropriato.

      - Tempo dall'insorgenza dei sintomi alla terapia chirurgica (se necessaria).

      • Gravità clinica al tempo 0 (emocoltura), e al giorno 2-3 e al giorno 30: punteggio della sepsi.

      4.5.3. Infiammazione, mediatori della sepsi e biomarcatori. - I seguenti biomarcatori saranno determinati durante l'arruolamento dei pazienti: - Conta e differenziale dei globuli bianchi. - Conta piastrinica. - Fibrinogeno. - Attività protrombinica.

      - Proteina C-reattiva.

      • Procalcitonina.
      • GZM A.

      I livelli sierici di GZM A saranno ottenuti in tutti i pazienti durante la visita di arruolamento, le visite di 2-3 giorni e le visite di 30 giorni (cinetica di GZM A). I livelli di GZM A saranno determinati mediante un saggio commerciale ELISA (Human Granzyme A ELISA development kit {HRP]; Mabtech).

      I polimorfismi del gene GzmA, così come altre mutazioni potenzialmente associate, saranno sottoposti a screening mediante Whole Exome Sequencing (WES). A tal fine, utilizzeremo il DNA isolato dalle cellule del sangue periferico e il kit di tecnologia AmpliSeq sulla piattaforma Ion Torrent seguendo le istruzioni del produttore. Questa piattaforma è disponibile presso la Genomics Central Research Unit (CRU) del CIBA dell'Università di Saragozza/IIS Aragon. Tutti i kit per l'isolamento e l'analisi dei campioni di DNA sono disponibili in commercio e ottimizzati da Thermo Scientific. L'analisi bioninformatica sarà eseguita da un accordo stabilito tra Genomics CRU e Micromics SL guidato da Pedro Gonzalez al CRG di Barcellona.

      4.5.4. Variabili microbiologiche

      • Le concentrazioni minime inibenti (MIC) degli isolati di E. coli recuperati dalle colture di urina e sangue saranno determinate attraverso pannelli di microdiluizione automatizzati come eseguito di routine dal Laboratorio di Microbiologia degli ospedali partecipanti.
      • Sequenziamento dell'intero genoma (WGS) dei ceppi di E. coli isolati in colture di sangue e di urina. Verrà analizzata la presenza di fattori di virulenza noti di E. coli e verrà calcolato un punteggio di virulenza per ciascun ceppo (Mora-Rillo et al., 2015).