Trascrittomica delle cellule mononucleate e stato infiammatorio dei pazienti obesi trattati con acidi grassi omega-3

Metodologia Disegno dello studio. Questo è uno studio prospettico, sperimentale, comparativo, non in cieco (aperto).

I pazienti adulti obesi (BMI ≥ 35,0 kg / m2), di età compresa tra 25 e 45 anni, di qualsiasi sesso saranno reclutati dalla Clinica ambulatoriale dell'obesità presso l'INCMNSZ. I pazienti possono avere (o meno) insulino-resistenza, ma non devono avere nessuna delle seguenti condizioni: diabete di tipo 2 (controllato o meno), ipertensione, insufficienza epatica o renale, sindrome metabolica, assunzione di farmaci antinfiammatori o integratori alimentari, e nel caso delle donne, in gravidanza o in allattamento.

Il gruppo di controllo sarà composto da 40 volontari adulti sani non obesi (BMI da 18,5 a 23,0 kg/m2), di età compresa tra 25 e 45 anni, di qualsiasi genere che accettano di partecipare allo studio. Questo gruppo sarà studiato solo all'inizio (tempo 0) e non consumerà l'integratore di olio di pesce, poiché il suo utilizzo sarà quello di ottenere valori di riferimento per tutte le variabili descritte.

L'integratore di olio di pesce sarà la fonte di acidi grassi omega-3 (w-3 FA) e questa sarà una donazione della Inflammation Research Foundation (IRF, Boston MA), sotto forma di flaconi sigillati non contrassegnati con 120 capsule/flacone.

Ogni capsula da 1 grammo contiene 0,6 g di w-3 FA (0,4 g di EPA e 0,2 g di DHA). Per fornire 4,8 g di w-3 FA ogni paziente obeso deve consumare 8 capsule al giorno, così distribuite: 2 capsule a colazione, 4 capsule al pasto principale e 2 capsule a cena.

Progettazione dello studio. Ogni partecipante (soggetti di controllo e pazienti obesi) riceverà 2 flaconi (240 capsule) di olio di pesce al momento del reclutamento (tempo 0) sufficiente a coprire il dosaggio per 1 mese. Trascorso il primo mese, verranno conteggiate le capsule rimanenti (se presenti) e verranno forniti 2 nuovi flaconi di integratore per coprire il dosaggio del mese successivo. Questa strategia verrà ripetuta alla fine del mese +2 per coprire il dosaggio del mese +3. Si osserverà un periodo di "wash-out" di almeno 1 mese (mese +4). Tutte le variabili descritte (eccetto l'antropometria) saranno analizzate ai tempi 0, +2 e +4.

Antropometria. Altezza in metri (m), peso in chilogrammi (kg), saranno utilizzati per calcolare l'indice di massa corporea (BMI) con la formula [peso (kg)/altezza (m)2]. La composizione corporea sarà determinata mediante bioimpedenza elettrica con un Full Body Composition Analyzer X-Contact 356, per quantificare la massa grassa (in % e in kg) e la massa magra (in % e kg). L'antropometria verrà eseguita solo ai tempi 0 e +4.

Campioni di sangue. Il sangue venoso sarà prelevato ai tempi 0, +1, +2, +3 e +4 con il sistema Vacutainer con anticoagulante (EDTA-K2). Un'aliquota di sangue sarà centrifugata per ottenere il plasma e conservata a -80°C fino al momento del dosaggio. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNC) saranno ottenute mediante centrifugazione in gradiente di densità (Lymphoprep). Queste cellule saranno ulteriormente processate per le seguenti determinazioni: i) analisi trascrizionale mediante RNA-seq e qPCR, ii) analisi in citometria a flusso di popolazioni di cellule immunitarie (B, T e monociti), iii) metabolismo cellulare ed energetico (Seahorse) e, iv) il saggio di "soppressione della proliferazione cellulare mediata da Treg (TMSCP)".

Analisi biochimiche. Saranno determinati i livelli sierici dei seguenti metaboliti, lipidi, citochine e adipochine: glucosio, insulina, colesterolo totale, HDL, LDL, trigliceridi, adipochine (leptina, adiponectina, IL-6, TNFalfa, MCP1) e interleuchina (IL) 1beta , 2, 4, 8, 10, 12, 17 e TGFbeta. I livelli di acidi grassi saranno determinati mediante gascromatografia in campioni di siero e nelle membrane cellulari di eritrociti e leucociti (PBMNC). La concentrazione di SPM (resolvine, protectine e maresine) sarà determinata mediante HPLC accoppiata ad uno spettrometro di massa.

Analisi bioenergetica di PBMNC. Il metabolismo cellulare sarà analizzato con un Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) delle cellule vive in un formato di piastra a 96 pozzetti. I tassi OCR ed ECAR sono rispettivamente indicatori chiave della respirazione mitocondriale e della glicolisi. Da questa analisi dei consumi energetici si otterrà un "indice di salute bioenergetica" (BHI). Questo BHI riflette la fonte dominante di energia impiegata dalle cellule e può riflettere la via metabolica impiegata. Ad esempio, se si ottiene una quantità elevata di OCR, ciò riflette un metabolismo aerobico (ossidazione degli acidi grassi e fosforilazione ossidativa, cioè FAO e OXPHOS), mentre un ECAR elevato indica un metabolismo anaerobico e la glicolisi è la principale via metabolica impiegata.

Analisi trascrizionale dell'espressione genica. L'RNA totale sarà ottenuto da PBMNC e sottopopolazioni (vale a dire, monociti e cellule Treg) utilizzando il reagente Trizol e la precipitazione con isopropanolo. L'integrità dell'RNA sarà determinata in gel di agarosio all'1% mediante elettroforesi e la sua concentrazione mediante spettrofotometria UV a 260nm.

Campioni di RNA con valori RIN di 8 e superiori verranno utilizzati per il sequenziamento; DNA complementare (cDNA) sarà sintetizzato con trascrittasi inversa e oligonucleotidi (dT)15. Le estremità dei frammenti di cDNA saranno ligate agli adattatori di sequenziamento e amplificate mediante PCR per produrre la libreria RNA-Seq, che sarà pronta per il sequenziamento. Il metodo di sequenziamento utilizzato nel presente studio sarà il sequenziamento di nuova generazione (NGS) con la piattaforma Illumina. La convalida dei cambiamenti nel livello di trascrizione determinati dall'analisi RNA-seq, sarà determinata mediante reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR) utilizzando un termociclatore RotorGeneQ e SybrGreen come etichetta. L'rRNA 18S sarà utilizzato come gene housekeeping.

L'uso più potente di RNA-Seq è trovare differenze nell'espressione genica tra due o più condizioni (ad esempio, obeso vs non obeso); questo processo è chiamato espressione differenziale. Gli output sono spesso indicati come geni espressi in modo differenziale (DEG) e questi geni possono essere regolati verso l'alto o verso il basso (cioè, più alti o più bassi nella condizione di interesse). Un punto limite di 2 volte la differenza con un valore p