Rischio personalizzato di aterosclerosi rapidamente progressiva (RPA)

Disegno dello studio: studio retrospettivo e prospettico continuo aperto con metodo a gruppi paralleli.

Nel lavoro di tesi sono stati definiti tre punti di controllo: il primo punto era retrospettivo, 2 anni prima dello studio; il secondo era il giorno dell'inserimento nello studio; e il terzo era di 12 mesi dopo l'inclusione.

Il punto retrospettivo ha coperto 2 anni dalla data di inclusione del paziente nello studio (periodo da gennaio 2019 a gennaio 2021) con determinazione di un ampio spettro di parametri di natura clinica, strumentale, di laboratorio potenzialmente influenzanti l'aspetto e la progressione dell'aterosclerosi (secondo l'analisi della letteratura). Gli esami menzionati sono stati eseguiti e valutati in due momenti: il primo - al momento del primo evento coronarico precedente durante il biennio retrospettivo, il secondo - al momento dell'inclusione del paziente nel presente studio. 202 pazienti sono stati divisi in due gruppi.

Metodi di studio. Al momento dell'inclusione (1 punto) nello studio, tutti i pazienti sono stati sottoposti a esame clinico generale con valutazione dei disturbi e dello stato clinico, esame di laboratorio con esami del sangue generali e biochimici, compreso uno speciale esame biochimico del siero del sangue per determinare il livello di alta sensibilità Proteina C-reattiva (CRP, mg/L) e spettro lipidico, incluso colesterolo totale (GC, mmol/L), lipoproteine ​​a bassa densità (LDL, mmol/L), lipoproteine ​​ad alta densità (HDL, mmol/L), trigliceridi (TG, mmol/L); analisi delle urine ed esami strumentali: elettrocardiografia (ECG), ecocardiografia (Echo-CG), R-grafia degli organi del torace, angiografia coronarica selettiva Oltre ai metodi di ricerca standard, tutti i pazienti saranno determinati parametri genetici molecolari. I metodi standard di indagine saranno ripetuti dopo un anno (2 punti).

Preparazione di preparazioni di DNA. L'estrazione del DNA dal sangue è stata eseguita mediante estrazione con fenolo-cloroformio. Da cinque a sei volumi di tampone A (10 mM Tris-HCl, pH=7,5; 10 mM NaCl; 3 mM MgCl2) sono stati aggiunti a 1 volume di campione di sangue e i coaguli sono stati strofinati in un omogeneizzatore. Dopo centrifugazione a 2500 g per 15 min, i precipitati sono stati lavati tre volte con tampone A e risospesi in 1 ml di tampone B (10 mM EDTA; 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH=8.5). Dopo aver aggiunto SDS allo 0,5% e proteinasi E a 200 μg/mL, la miscela è stata incubata per 12 ore a 56°C. La deproteinizzazione è stata eseguita in sequenza con miscela fenolo-cloroformio (1:1), fenolo saturo d'acqua, miscela fenolo-cloroformio (1:1) e cloroformio. Il DNA è stato precipitato aggiungendo una soluzione di NaCl a 1 M e 1 V di alcool isopropilico. Successivamente, la soluzione è stata raffreddata per 1 ora a -20°C. Il precipitato ottenuto mediante centrifugazione su una microcentrifuga Eppendorf a 12000 g per 15 minuti è stato lavato tre volte con etanolo al 75% seguito da centrifugazione per 5 minuti. 12000g e, dopo essiccamento a 56 °C, sciolto in acqua deinanilizzata ad una concentrazione di DNA di 0,5 µg/μl. La genotipizzazione dei polimorfismi è stata eseguita utilizzando la PCR in tempo reale secondo il protocollo del produttore (taqMan probes, Thermo Fisher Scientific, USA) su uno strumento StepOnePlus. Sono stati selezionati in base ai risultati di studi internazionali di associazione sull'intero genoma (GWAS), che hanno confermato l'associazione di questi SNP con la malattia coronarica (CHD), un processo infiammatorio che svolge un ruolo significativo nella progressione dell'aterosclerosi.

Metodi di analisi statistica. Il pacchetto software SPSS 22.0 sarà utilizzato per l'analisi statistica dei dati genetico-molecolari. La prima fase sarà determinare le frequenze dei genotipi e degli alleli degli SNP studiati nel gruppo di pazienti con infarto del miocardio con valori elevati di marcatori cardiospecifici e nel gruppo di confronto, dove i marcatori cardiospecifici saranno entro i limiti normali; quindi valuteremo la conformità delle frequenze genotipiche con l'equilibrio di Hardy-Weinberg nel gruppo di controllo (utilizzando il criterio del chi-quadrato). Ci sarà un confronto dei livelli di indicatori come l'età; livello di creatinina; livello diagnostico dei biomarcatori di necrosi miocardica: MB creatina chinasi e troponina, proteina legante gli acidi grassi (FABP); indice di massa corporea; girovita; concentrazione sierica di peptide C; livelli di glicemia all'ingresso e alla dimissione; livelli di emoglobina nel sangue all'ingresso e alla dimissione; Pressione arteriosa sistolica e diastolica al momento del ricovero; frequenza cardiaca al momento del ricovero; valore della frazione di eiezione ventricolare sinistra mediante ecocardiografia; concentrazione sierica di HCMP; lipidogramma: concentrazione sierica di lipoproteine ​​a bassa densità (LDL), lipoproteine ​​ad alta densità (HDL), colesterolo totale, trigliceridi; altezza, peso, indice di massa corporea, nei portatori di diversi genotipi sono stati eseguiti dopo aver verificato la normalità della distribuzione di queste caratteristiche mediante il test di Kolmogorov-Smirnov. Se i tratti soddisfacessero i criteri della distribuzione normale, verrebbe utilizzata un'analisi della varianza a fattore singolo. La significatività delle differenze tra due classi genotipiche sarà inoltre verificata utilizzando il t-test per due campioni indipendenti. Se un carattere in studio non soddisfa i criteri di distribuzione normale, il confronto del livello di questo carattere in portatori di genotipi diversi sarà effettuato utilizzando il test di Kruskal-Wallis; l'attendibilità delle differenze tra le due classi genotipiche sarà ulteriormente verificata utilizzando il test di Mann-Whitney per due campioni indipendenti. L'associazione di SNP con fattori di rischio legati a variabili categoriali sarà testata con tabelle di coniugazione utilizzando il test chi-quadro di Pearson. Nel caso di tabelle a quattro campi, il confronto dei campioni per genotipo e frequenze alleliche utilizzerà il criterio esatto a due code di Fisher. Il rischio relativo (OR - odds ratio) dell'esito della malattia/presenza di fattori di rischio per un particolare allele o genotipo sarà calcolato come odds ratio.

L'influenza dei parametri clinici, demografici, funzionali, metabolici, infiammatori e dei marcatori di necrosi miocardica sulla prognosi a lungo termine sarà valutata mediante odds ratio (intervallo di confidenza 0,95).