BAFF-var come biomarcatore di risposta al trattamento con deplezione di B nel lupus eritematoso sistemico e nell'artrite reumatoide (PREDICT)

SFONDO

Il lupus eritematoso sistemico (LES) e l'artrite reumatoide (RA) sono malattie immuno-mediate multisistemiche caratterizzate da una patogenesi complessa, in cui un'attivazione anormale della risposta immunitaria umorale, con sovrapproduzione di autoanticorpi, ha dimostrato di avere un ruolo fondamentale.

Lo stimolatore dei linfociti B (BAFF) è una citochina e un bersaglio farmacologico prodotto principalmente da monociti e neutrofili. È essenziale per l'attivazione, la differenziazione e la sopravvivenza delle cellule B. È stato dimostrato che la sovraespressione di BAFF è associata a pattern più gravi di LES e correlata a positività più frequenti per anti-Sm (OR 1,7; 95% CI 1,3, 2,2), titoli anti-dsDNA ad alto titolo (OR 1,5; 95% CI 1,1, 2.2), minore C3 (OR 1.3; 95% CI 1.0, 1.8), proteinuria più alta (OR 1.8; 95% CI 1.4, 2.4) e aumento del rischio di riacutizzazione (HR 1.86; 95% CI 1.29, 2.68). Allo stesso modo, alti livelli di BAFF sono stati osservati nel sangue e nel liquido sinoviale dei pazienti affetti da AR e hanno dimostrato di essere correlati con una maggiore attività della malattia nell'AR.

Belimumab e rituximab sono la forma prototipica delle terapie mirate alle cellule B attualmente approvate rispettivamente per SLE e RA.

Belimumab, un anticorpo monoclonale completamente umanizzato diretto contro BAFF, è il primo farmaco biologico autorizzato e approvato per l'uso in combinazione con immunosoppressori standard nel LES. I dati degli RCT hanno dimostrato che una maggiore attività della malattia, la positività anti-dsDNA, il basso complemento e il trattamento con corticosteroidi possono predire un maggiore beneficio per belimumab. Tuttavia, circa il 40% dei soggetti non ha ottenuto una risposta adeguata.

Rituximab (RTX) è un anticorpo monoclonale chimerico che inibisce selettivamente il recettore CD20 sulla superficie dei linfociti B. L'uso di RTX, preferibilmente in combinazione con metotrexato, è indicato nei pazienti con AR che non rispondono al trattamento con immunosoppressori tradizionali. Sebbene sia stata registrata una maggiore efficacia nei pazienti con positività per autoanticorpi (es. fattore reumatoide e peptide anti-citrullinato), anche in questo caso circa il 30-40% dei pazienti non risponde adeguatamente.

Una variante del gene TNFSF13B che codifica per BAFF (BAFF-var), particolarmente comune in tutta la Sardegna (frequenza allelica, 26,5%) e progressivamente meno comune nell'Europa meridionale (5,7% in Italia, 5,0% in Spagna e Portogallo) e settentrionale (1,8% nel Regno Unito e in Svezia), è stato associato a malattie autoimmuni, tra cui LES e RA. La variante causale è stata identificata come variante di inserzione-delezione, producendo una trascrizione più breve che è sfuggita all'inibizione del microRNA e ha aumentato la produzione di BAFF solubile, che a sua volta ha regolato l'immunità umorale. In particolare, BAFF-var è stato associato ad un aumento del livello di BAFF solubile (dimensione dell'effetto 0,77 deviazioni standard (DS); P= 8,47 x10-150), IgG (0,31 SD, p=1,68x10-12), IgA (0,31 DS, p=7,64x10-9), IgM (0,31 DS, p=4,70x10-8), così come un aumento del numero totale di cellule B (0,18 DS, P=4,23x10-12) e diversi sottotipi, tra cui CD24+CD27+ (comprendente memoria non commutata e commutata ) (0,22 DS, P=2,94x10-10) come fortemente associato. Inoltre, i dati del trascrittoma hanno dimostrato BAFF-var come un locus del tratto quantitativo di espressione che aumenta l'espressione di TNFSF13B ( P = 2, 37 × 10-13). Tuttavia, i livelli elevati di mRNA potrebbero spiegare solo il 24-27% dell'effetto sulle proteine, indicando che probabilmente era coinvolto anche un aumento del livello di traduzione. A questo proposito, i dati indicano che BAFF-var aumenta i livelli di BAFF solubile favorendo la produzione di un trascritto più breve che è meno inibito dal microRNA, come il miR-15a6.

Conoscere l'effettiva influenza di BAFF-var nelle modificazioni immunologiche, molecolari e cliniche indotte dall'inibizione di BAFF ha un'importanza cruciale nella prospettiva di una medicina personalizzata nei pazienti affetti da LES e AR.

OBIETTIVI

• Obiettivo primario: esplorare le basi immunologiche di un potenziale ruolo di BAFF-var come biomarcatore prognostico per la risposta a belimumab o rituximab rispettivamente nei pazienti in trattamento con SLE e RA. Più in dettaglio, lo studio mira a valutare se la condizione di portatore di BAFF-var influenza le modificazioni farmaco-correlate di variabili immunologiche e molecolari, quali: (a) citochine BAFF solubili (BAFFs), (b) mRNA-BAFF (c ) miRNA-15a (d) sottopopolazioni di cellule B.
• Obiettivi secondari: esplorare l'effetto di BAFF-var sul tasso di risposta clinica a belimumab o rituximab, come valutato da diverse misure di esito.

DISEGNO E METODOLOGIA DELLA RICERCA

• Disegno dello studio: Il progetto proposto è uno studio osservazionale longitudinale
• Popolazione: La distribuzione di BAFF-var e le modificazioni su variabili immunologiche, molecolari e cliniche, dopo l'inizio del trattamento con agente anti-BAFF, saranno analizzate su una coorte sarda monocentrica di pazienti affetti da SLE e RA. A questo proposito, il sardo rappresenta la popolazione più adatta per questo tipo di analisi a causa della maggiore frequenza di BAFF-var; infatti la condizione di portatore BAFF-var è attesa nel 50-60% dei pazienti. Saranno reclutati circa 30 pazienti consecutivi di SLE e 30 consecutivi di AR afferenti all'Unità di Reumatologia del Dipartimento di Scienze Mediche e Sanità Pubblica dell'Università e Clinica Universitaria di Cagliari.
• Raccolta dati: demografici (ad es. sesso, età all'arruolamento, età di insorgenza e diagnosi), clinica (ad es. manifestazioni di malattia cumulative e attive, misure clinimetriche), sierologiche (ad es. saranno raccolti autoanticorpi, inclusi anti-dsDNA, C3 e C4, IgG, IgA, IgM, RF, ACPA) e terapeutici (ad esempio terapie passate e attuali).
• Genotipizzazione BAFF: per la genotipizzazione BAFF, i campioni di sangue intero saranno raccolti in EDTA al momento dell'arruolamento. Il gDNA sarà estratto con il metodo salting-out secondo il protocollo standard. Il saggio Customs TaqMan (Thermo Fisher Scientific) specificamente progettato per genotipizzare le varianti BAFF di interesse sarà utilizzato con Real Time PCR allele-specifica in tutti i campioni.
• Fenotipizzazione delle cellule B: la citometria a flusso verrà utilizzata per profilare le sottopopolazioni di cellule B nei 30 pazienti SLE arruolati. Il numero di cellule B (CD45+CD19+), così come il numero assoluto e relativo di transizioni B (CD24+CD38+), secernenti anticorpi (ASC, CD27+CD38+), memorie B commutate (CD27+IgD-), memorie B cellule non commutate (CD27+IgD+), B naïve (IgD+CD27-CD24-) e B regolatorie (CD24+CD27+) saranno valutate mediante protocollo Lyse-No-Wash utilizzando BD TruCountTM (Becton Dickinson).
• BAFF solubile: sarà misurato mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)
• Studio dell'espressione genica: l'mRNA sarà estratto dal sangue intero mediante Trizol Reagent e l'analisi quantitativa di mRNA-BAFF e miRNA-15a sarà eseguita mediante Real-Time PCR utilizzando sonde TaqMan specifiche, previa trascrizione inversa in cDNA.
• Analisi statistica. L'analisi statistica verrà eseguita utilizzando il software statistico SPSS®. Il confronto dei livelli medi di sBAFF, mRNA-BAFF, miRNA-15a e diversi fenotipi di cellule B tra BAFF-var + e BAFF-var - i pazienti ad ogni visita saranno eseguiti dal test T-Student o dal test di Mann Whitney, se appropriato. Confronto della differenza media dei livelli di sBAFF, mRNA-BAFF, miRNA-15a e sottopopolazioni di cellule B tra BAFF-var + e BAFF-var - i pazienti ai diversi intervalli di visita saranno eseguiti dal test T-Student o dal test di Mann Whitney , se è appropriato. L'effetto di BAFF-var sulla modifica dei livelli delle variabili immunologiche e molecolari di cui sopra sarà ulteriormente valutato mediante regressione multipla, includendo come variabili indipendenti, trattamenti concomitanti e caratteristiche della malattia al basale. Il test esatto di Fisher e l'analisi di regressione logistica saranno eseguiti per confrontare il tasso di risposta, come valutato da diverse misure di efficacia, nei pazienti BAFF-var + e BAFF-var -.