Steatosi epatica nei pazienti pediatrici con malattia celiaca

Background La celiachia (MC) è un'enteropatia autoimmune innescata dall'assunzione di glutine (un componente essenziale del grano), caratterizzata da una predisposizione genetica (antigene leucocitario umano DQ2/DQ8). Si tratta di una patologia molto diffusa, con una prevalenza stimata a livello mondiale pari a circa l'1%, caratterizzata sia da disturbi gastrointestinali (diarrea, dolori addominali, meteorismo, ecc.) che sistemici (astenia, cefalea, manifestazioni cutanee, anemia, aumento delle transaminasi, ecc.), sintomi, sia negli adulti che nei bambini, che solitamente si risolvono eliminando il glutine dalla dieta (Dieta Senza Glutine, GFD). Tuttavia, anche se nel decennio le diagnosi di celiachia sono in aumento, rimane ancora una patologia sottodiagnosticata (ad oggi la prevalenza complessiva in Italia è dello 0,37% e in Sicilia dello 0,35%).

Sebbene la malattia di Crohn sia spesso associata a sintomi di malassorbimento (steatorrea, perdita di peso, deficit nutrizionali, ecc.), un numero crescente di soggetti affetti è in sovrappeso o francamente obeso. Una delle condizioni che più frequentemente si riscontra nei soggetti pauci/asintomatici è l'aumento delle transaminasi, che spesso regredisce completamente dopo l'inizio della dieta senza dieta.

Più recentemente, una specifica patologia epatica ha mostrato una certa rilevanza nei pazienti affetti da celiachia, tanto che la Società Europea per lo Studio della Malattia Celiaca (ESsCD) l'ha citata tra le possibili comorbidità da sottoporre a screening nei soggetti celiaci: -Malattia del fegato grasso alcolica (NAFLD). Questa condizione colpisce circa il 34% dei bambini in sovrappeso o francamente obesi ed è strettamente correlata, sia nei bambini che negli adulti, ai tratti tipici della sindrome metabolica, tanto che oggi viene preferibilmente definita Malattia Epatica Steatosica Associata a Disfunzione Metabolica ( MASLD). Negli adulti è stata dimostrata un'associazione non casuale tra CD e NAFLD, mostrando un tasso di prevalenza di CD del 2-14% tra i pazienti con NAFLD. Pochi studi si sono concentrati su questo stesso aspetto in età pediatrica, riportando tuttavia che la prevalenza della malattia di Crohn tra i bambini affetti da NAFLD potrebbe essere paragonabile alla prevalenza della malattia di Crohn nella popolazione pediatrica generale. Tuttavia, uno studio condotto su 11.488 bambini (0-19 anni) affetti da celiachia rispetto a 57.029 bambini sani (della stessa età e sesso) supporta l'ipotesi di una stretta associazione tra celiachia e NAFLD nell'infanzia. Gli autori hanno dimostrato un 4,6 (intervallo di confidenza al 95% = 2,3-9,1) valore di rischio relativo della NAFLD nei pazienti con malattia di Crohn.

Diversi fattori sono stati indicati come responsabili di questa associazione: 1) squilibri alimentari dovuti all'adozione della dieta priva di glutine, ricca di grassi e zuccheri e povera di fibre; 2) alterazione della permeabilità intestinale tipica dei pazienti affetti da celiachia, con aumento della traslocazione di sostanze batteriche dal lume intestinale, che, entrando nel circolo portale, vengono trasportate direttamente al fegato, dove sono in grado di generare processi infiammatori mediati dal fattore nucleare potenziatore della catena leggera kappa delle cellule B attivate (NF-kB), attivato dal complesso Tool-like recettore 4 (TLR4)-Lipopolisaccaride (LPS)-Lipopolisaccaride Binding Protein (LPB), con produzione di proteine ​​proinfiammatorie citochine [fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, interleuchina (IL)-1β, IL-6, IL-12, IL-18); 3) alterazioni del microbiota intestinale, che potrebbero essere in grado non solo di modificare l'assorbimento dei nutrienti, ma anche di amplificare il danno alla mucosa.

Obiettivi

Gli obiettivi di questo studio sono:

Obiettivo primario: definire, retrospettivamente, la prevalenza della NAFLD in una popolazione pediatrica affetta da CD e studiare la sua possibile associazione con la dieta priva di glutine:

Obiettivo 1.1: identificare la prevalenza della NAFLD prima dell’introduzione della dieta senza dieta (e quindi prima della diagnosi di celiachia) in una popolazione pediatrica di celiachia già diagnosticata presso la Clinica Pediatrica dell’Ospedale Pediatrico “G. Di Cristina"; Obiettivo 1.2: identificare la prevalenza di NAFLD dopo almeno 12 mesi di dieta senza glutine (e quindi dopo la diagnosi di celiachia) in una popolazione pediatrica celiaca già diagnosticata presso la Clinica Pediatrica dell'Ospedale Pediatrico "G. Di Cristina"; Obiettivo 1.3: confrontare la prevalenza della NAFLD prima e dopo (almeno 12 mesi) l'introduzione della dieta priva di glutine in tutti i pazienti celiaci pediatrici per i quali sono disponibili dati sia pre che post-GFD; Obiettivo 1.4: stabilire un possibile correlazione tra presenza/assenza di NAFLD sia prima (popolazione target 1.1) che dopo (popolazione target 1.2) l'adozione della GFD e parametri clinici, di laboratorio, immunologici, genetici e istologici, al fine di identificare un sottogruppo di bambini celiaci potenzialmente predisposti allo sviluppo della NAFLD; Obiettivo 1.5: stabilire eventuali variazioni dei parametri clinici, laboratoristici, immunologici, genetici e istologici della popolazione di cui all’obiettivo 1.3 e stabilire se esiste una correlazione tra questi e l’eventuale insorgenza/regressione della NAFLD.

Obiettivo secondario: definire il possibile ruolo dell'alterazione della permeabilità intestinale e/o del danno alla mucosa intestinale e/o dello stato proinfiammatorio nello sviluppo della NAFLD nei bambini affetti da CD:

Obiettivo 2.1: identificare l'eventuale presenza di marcatori sierologici di alterata permeabilità intestinale e/o di danno alla mucosa intestinale in una popolazione di bambini celiaci arruolati prospetticamente presso la Clinica Pediatrica dell'Ospedale Pediatrico "G. Di Cristina" prima dell'inizio della GFD (T0).

Obiettivo 2.2: Identificare l'eventuale presenza di marcatori ematici di infiammazione nella popolazione di cui al punto 2.1 prima dell'inizio della GFD (T0).

Obiettivo 2.3: definire l'esistenza di un'associazione tra i marcatori di alterata permeabilità intestinale e/o di danno e/o infiammazione della mucosa e la presenza di NAFLD nella popolazione di cui al punto 2.1 prima dell'inizio della GFD (T0).

Obiettivo 2.4: valutare eventuali variazioni dei marcatori sierologici di alterata permeabilità intestinale e/o danno mucosale nella popolazione di cui al punto 2.1 dopo 6 mesi di stretta aderenza alla DGF (T1).

Obiettivo 2.5: valutare eventuali variazioni dei marcatori ematici di infiammazione nella popolazione di cui al punto 2.1 dopo 6 mesi di stretta aderenza alla GFD (T1).

Obiettivo 2.6: definire l’esistenza di un’associazione tra i marcatori di alterata permeabilità intestinale e/o di danno e/o infiammazione della mucosa e la presenza di NAFLD nella popolazione di cui al punto 2.1 dopo 6 mesi di stretta aderenza alla DGF (T1) .

Materiali e metodi Obiettivo primario Per raggiungere l'obiettivo primario dello studio, sono state utilizzate tutte le cartelle cliniche dei pazienti pediatrici affetti da celiachia già diagnosticata secondo i criteri della Società Europea di Gastroenterologia Pediatrica Epatologia e Nutrizione (ESPGHAN) presso la Clinica Pediatrica dell'Ospedale Pediatrico" G. Di Cristina" verrà analizzato retrospettivamente.

Obiettivi 1.1, 1.2 e 1.3 Per raggiungere gli obiettivi 1.1 e 1.2, la presenza e il grado di steatosi diagnosticata mediante ecografia addominale verranno valutati prima dell'inizio della GFD (obiettivo 1.1) o dopo almeno dodici mesi dall'introduzione della GFD (obiettivo 1.2).

Per raggiungere l'obiettivo 1.3, verrà effettuata una sottoanalisi della presenza e del grado di steatosi in tutti quei pazienti che sono stati sottoposti ad ecografia addominale sia prima che dopo l'introduzione della dieta senza dieta.

La steatosi epatica verrà accertata mediante esame ecografico e classificata come segue: assente (punteggio 0), quando l'ecostruttura del fegato è normale; lieve (punteggio 1), quando si riscontra un lieve e diffuso aumento dell'ecogenicità epatica, con visualizzazione normale della parete della vena porta e del diaframma; moderato (punteggio 2), in caso di moderato aumento dell'ecogenicità epatica, con aspetto leggermente alterato della parete della vena porta e del diaframma; grave (punteggio 3), in caso di marcato aumento dell'ecogenicità epatica, con scarsa o assente visualizzazione della parete della vena porta, del diaframma e della parte posteriore del lobo epatico destro.

Obiettivi 1.4 e 1.5 Per raggiungere l'obiettivo 1.4, raccoglieremo dati clinici (sesso, etnia, età alla diagnosi, BMI, sintomi, durata della dieta senza glutine), laboratoristici (transaminasemia, albuminemia, colesterolemia totale e sottoclassi, trigliceridemia, glicemia a digiuno, insulinemia, omeostasi Modello di valutazione della resistenza all'insulina (Indice HOMA-IR), immunologico [anticorpi anti-gliadina (AGA), anticorpi anti-transglutaminasi tissutale (tTG), anticorpi anti-endomisio (EMA)], genetico (struttura HLA) e istologico (esame istologico duodenale Marsh classificazione, presenza di infiltrazione eosinofila, ecc.) dati di tutti i pazienti inclusi, sia prima (popolazione target 1.1) che dopo (popolazione target 1.2) l'introduzione della dieta senza glutine.

Per raggiungere l’obiettivo 1.5 verranno analizzati gli stessi parametri clinici, di laboratorio, immunologici, genetici ed istologici analizzati per l’obiettivo 1.4, se disponibili sia prima che dopo l’introduzione della DGF, al fine di stabilire se esiste una correlazione tra questi e quelli possibile insorgenza/regressione della NAFLD nella popolazione di cui all'obiettivo 1.3.

Obiettivo secondario Per raggiungere l'obiettivo secondario dello studio, pazienti pediatrici affetti da celiachia di nuova diagnosi secondo i criteri ESPGHAN verranno arruolati in modo prospettico presso la Clinica Pediatrica dell'Ospedale Pediatrico "G. Di Cristina". Il numero di soggetti da arruolare sarà pari a 91, considerando, nella Provincia di Palermo, Sicilia, Italia, una popolazione pediatrica (tra 0 e 14 anni) di 170.468 soggetti, una prevalenza di CD pari all'1%, un dato di confidenza livello del 95% e un intervallo di confidenza del 10%. Inoltre, poiché non conosciamo l'esatta prevalenza della NAFLD nei bambini con malattia di Crohn, ci baseremo sui risultati dello studio retrospettivo (obiettivo 1.1) per mantenere una proporzione tra soggetti arruolati senza e con NAFLD pre-GFD ("competitive iscrizione").

Obiettivi 2.1, 2.2, 2.3 Per raggiungere l'obiettivo 2.1 devono essere disponibili tutti i soggetti arruolati, per i quali devono essere disponibili gli stessi parametri clinici, di laboratorio, immunologici, genetici e istologici analizzati per l'obiettivo 1.4 (questi ultimi solo se necessari per la diagnosi), in modo da poter effettuare per un confronto possibile, sarà sottoposto a prelievo di sangue per l'identificazione di marcatori sierologici di alterata permeabilità intestinale [zonulina (Zo), occludina (OCLN), anticorpi anti-OCLN, anticorpi claudina 1 (CLDN1) e anti-CLDN1] e di danno della mucosa [Proteina legante gli acidi grassi intestinali 2 (iFABP2)], lipopolisaccaride (LPS), proteina legante i lipopolisaccaridi (LPB)] prima di iniziare la dieta senza dieta senza glutine (T0). Il prelievo di sangue coinciderà con quello necessario alla definizione diagnostica del quadro clinico del paziente.

Per raggiungere l'obiettivo 2.2, tutti i soggetti arruolati verranno sottoposti a un prelievo di sangue prima di iniziare la dieta senza dieta priva di glutine (T0), per l'identificazione dei seguenti marcatori infiammatori: TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-18. Il prelievo di sangue coinciderà con quello necessario alla definizione diagnostica del quadro clinico del paziente.

Per raggiungere l'obiettivo 2.3, tutti i soggetti arruolati, prima di iniziare la GFD (T0), verranno sottoposti ad ecografia addominale per studiare la steatosi epatica secondo le modalità precedentemente descritte e verrà effettuata un'analisi di correlazione statistica tra la presenza/assenza di NAFLD e la marcatori saggiati per gli obiettivi 2.1 e 2.2.

Il dosaggio dei marcatori di permeabilità intestinale e di danno mucosale sarà effettuato utilizzando il metodo ELISA, con kit disponibili in commercio, seguendo le istruzioni dei produttori.

La misurazione dei marcatori di infiammazione sarà effettuata mediante colorazione intracellulare con metodo citofluorimetrico su cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) estratte da campioni di sangue dei pazienti.

Obiettivi 2.4, 2.5, 2.6 Per raggiungere l'obiettivo 2.4, tutti i soggetti arruolati, per i quali dovranno essere disponibili gli stessi parametri clinici, laboratoristici ed immunologici analizzati al T0, al fine di rendere possibile un confronto, saranno sottoposti ad un prelievo di sangue per l'identificazione di marcatori sierologici di alterata permeabilità intestinale e danno mucosale già misurati al T0 (vedi obiettivo 2.1), dopo 6 mesi di stretta aderenza alla GFD (T1). Il prelievo di sangue coinciderà con quello necessario per rivalutare il quadro clinico del paziente dopo 6 mesi di aderenza alla GFD.

Per raggiungere l'obiettivo 2.5, tutti i soggetti arruolati verranno sottoposti a un prelievo di sangue per identificare i marcatori di infiammazione già dosati a T0 (vedi obiettivo 2.2), dopo 6 mesi di stretta aderenza alla GFD (T1). Il prelievo di sangue coinciderà con quello necessario per rivalutare il quadro clinico del paziente dopo 6 mesi di aderenza alla GFD.

Per raggiungere l’obiettivo 2.6, tutti i soggetti arruolati, dopo 6 mesi di stretta aderenza alla DGF (T1), verranno sottoposti ad ecografia addominale per studiare la steatosi epatica secondo le metodiche precedentemente descritte e verrà effettuata un’analisi di correlazione statistica tra presenza/assenza della NAFLD e i marcatori dosati per gli obiettivi 2.4 e 2.5.

La valutazione dell'adesione alla GFD verrà effettuata attraverso la compilazione mensile, da parte dei bambini e/o dei loro genitori, di un questionario appositamente realizzato e validato.