"BP come nuovo dispositivo per la chirurgia e il trattamento del cancro solido e dei tumori del sistema ematopoietico. Effetti dell'impianto di BP" (DM159)

Il Buckypaper (BP) è un materiale innovativo che ha attirato l'attenzione di molti gruppi di ricerca impegnati nello studio delle sue possibili applicazioni in diversi campi tecnologici propedeutici alla sperimentazione umana. Infatti la sperimentazione, condotta preliminarmente su modello animale, sarà applicabile all'uomo, se i risultati in termini di tossicità e durabilità saranno soddisfacenti.

Le interessanti proprietà del materiale, quali buona resistenza meccanica, conducibilità elettrica, bassa densità, porosità adattabile, sono strettamente associate alle caratteristiche intrinseche dei nanotubi di carbonio (CNT), di cui è composto BP. L'elevato sviluppo superficiale dei CNT, oltre a favorirne l'aggregazione, consente la preparazione di membrane micro e nanoporose che escludono il passaggio di particelle colloidali con diametro superiore a 50 nm. La struttura microporosa, inoltre, conferisce al BP un'elevata capacità di assorbimento di liquidi, come l'acqua, per cui per effetto della capillarità, penetra rapidamente nel materiale della rete. Questa potrebbe essere una possibile interpretazione della rapida ed efficace adesione della BP ai tessuti biologici osservata nei nostri studi sugli effetti del materiale impiantato in vivo. La bioadesione di BP è stata documentata in esperimenti ex vivo di peeling meccanico (chirurgia da banco), condotti preventivamente utilizzando come substrato cavia, ratti, fascia muscolare addominale di coniglio. I risultati hanno mostrato che la forza richiesta per il distacco della PA dal supporto organico è molto maggiore di quella richiesta per le protesi convenzionali realizzate con reti polimeriche, comunemente utilizzate nella chirurgia dell'ernia fissate con colla e materiale protesico biologico bioadesivo sintetico attualmente in commercio. Sulla base di queste valutazioni e sulla base delle potenzialità offerte dall'utilizzo dei BP nel campo della chirurgia protesica, deducibili dalle caratteristiche intrinseche del materiale, in questo progetto si prevede un'ulteriore ricerca per lo sviluppo di una nuova generazione di materiali protesici da utilizzare BP a base chirurgica, facilmente impiantabili dal chirurgo senza bisogno di suture, graffe e/o colle biologiche. I motivi sono:

1. punti di sutura: potrebbero stringere il nodo dei vasi (ischemia-atrofia) o dei nervi (dolore cronico);
2. grafici: posizionamento cieco e può causare sanguinamento o dolore;
3. colle biologiche: derivano dal plasma dei donatori e quindi potrebbero trasmettere malattie sconosciute.

Non è ancora noto se BP abbia le proprietà meccaniche adeguate per sopportare le sollecitazioni che si verificano sulla parete addominale e comunque è documentata la buona bioadesione su tessuti vivi e preparati anatomici, ma solo se resi umidi.

Per questo motivo si è deciso di preparare materiali compositi BP/polipropilene. Tali materiali, definiti "accoppiati", saranno ottenuti facendo aderire sulla faccia liscia di BP, supporto polimerico che conferisce al film ibrido, la corretta resistenza meccanica. Tale sistema può essere soggetto a ulteriori modifiche. Infatti, sfruttando i gruppi funzionali presenti o introdotti nella struttura cristallina dei MWCNT e/o sul polimero, sarà possibile impiantare sulla superficie del muscolo/fascia muscolare, il materiale composito, per ottenere grippaggio. Inoltre, nella struttura cristallina dei MWCNT possono essere introdotte molecole biologicamente attive, con funzioni antimicrobiche, antiadesive, antinfiammatorie o analgesiche, per modulare la risposta infiammatoria e l'incorporazione del materiale impiantato nella cicatrice fibrosa.

L'obiettivo di questo progetto è quello di ottenere risultati che possano orientare la ricerca per la realizzazione definitiva di un dispositivo protesico per uso in chirurgia addominale applicabile all'uomo.

Il nostro Gruppo di Ricerca propone che il presente programma di ricerca abbia tutte le competenze per raggiungere tutti gli obiettivi.

Riunisce ricercatori di comprovata competenza ed esperienza in vari campi della Chirurgia Generale e della Chirurgia Protesica della parete addominale ed Esperti Scienziati di Scienza dei Materiali soprattutto di natura polimerica, anche per usi biomedici, Chimica Organica, e sintesi di bio-coniugati per lo sviluppo di sistemi a lento rilascio di farmaci, caratterizzazione di sistemi biologici mediante tecniche di risonanza magnetica nucleare (NMR). Il chirurgo dell'unità di ricerca, infatti, da molti anni è impegnato sia nella risoluzione di problematiche legate alle tecniche chirurgiche, sia nella valutazione degli effetti sull'organismo vivente dei materiali protesici convenzionali e innovativi, nella proposta progettuale , anche attraverso test in vivo, condotti secondo un protocollo appositamente predisposto e approvato dal Ministero della Salute.

Il protocollo è stato redatto nel rispetto delle politiche ambientali, e dei principi etici sulla sperimentazione su modello animale, in accordo con le linee guida dell'Unione Europea (86/609/CEE-Comunità Economica Europea), e della Legge Italiana n° 116/ 92.

Verranno condotti esperimenti sistematici su 30 conigli femmine neozelandesi (R1-R30), del peso di circa 3000 g (Harlan Laboratories). Le indagini "in vivo" riguarderanno la biocompatibilità e l'adesione di BP nella cicatrice addominale e nell'esecuzione dell'intervento di ernia incisionale e chirurgia plastica dell'ernia inguinale.

La biocompatibilità della BP sarà studiata mediante esami ematochimici. Prelievi di sangue di 3 ml di sangue intero verranno eseguiti su ogni animale dopo l'induzione dell'anestesia generale, dalla vena dell'orecchio, prima dell'intervento chirurgico con impianto protesico e prima dell'eutanasia come indicato nel Programma orario.

Metodologia e tecnica dell'esperimento:

Questi esperimenti sono preliminari all'uso umano e saranno eseguiti in anestesia generale con intubazione endotracheale, quindi depilazione, disinfezione e preparazione del campo operatorio. Verrà eseguita un'incisione della linea mediana di circa 10 cm ombelico-pubico, allargando la pelle e gli strati sottocutanei, quindi verrà inciso il piano fasciale e i muscoli in profondità per entrare nel sacco peritoneale. L'esecuzione del prelievo ematico coincidente con la rilevazione del peso corporeo e l'esecuzione di ecografia della regione addominale per lo studio del sito implantare alla ricerca di segni di sepsi ed ernia incisionale.

Impianteremo questo tipo di nuovi materiali sull'uomo ma prima di ciò cercheremo di studiarne la tollerabilità e la tossicità su un modello animale così disegnato: dieci conigli (di seguito definiti come BPR1-BPR10) (Buckypaper Rabbit soggetti da 1 a 10) riceveranno Campioni 2x2cm2 di BP (Buckypaper) e dieci conigli riceveranno campioni 2x2cm2 di PR (polipropilene) (PRR11-PRR20) in una tasca creata tra fascia muscolare e grandi muscoli della parete addominale. In cinque conigli (BPR21-BPR25), l'incisione chirurgica sarà effettuata sulla linea alba addominale ed eseguita in profondità, per entrare nella cavità addominale. Il gruppo di controllo (R26-R30) non sarà sottoposto ad intervento chirurgico.

Verrà quindi inserito un campione di 2x2cm2 BP con il lato ruvido rivolto verso la superficie del peritoneo parietale e la superficie liscia e brillante rivolta verso il peritoneo viscerale (BPR21-BPR25). Cinque conigli (R26-R30) non saranno operati ma saranno utilizzati come gruppo di controllo. Gli animali saranno monitorati e controllati giornalmente, durante l'intero periodo studiato, al fine di valutare costantemente il loro stato di salute ed il peso corporeo. Al 35° giorno verrà prelevato un campione di sangue per l'esame. Infine gli animali saranno sacrificati in anestesia generale.

I casi BPR1-BPR10 (gruppo A) saranno confrontati con i PRR11-PRR20 (gruppo di controllo B) confrontando gli effetti degli impianti di BP e della stessa taglia in Parietene già in uso nella chirurgia ricostruttiva dell'uomo sano. Dopo l'intervento, che durerà circa 60 minuti dal momento dell'induzione, l'animale verrà lentamente risvegliato e poi riportato nella stanza di stabulazione.

Al momento del sacrificio verranno preparati campioni anatomici di tutti i visceri e del sito di impianto, da studiare istologicamente. Saranno preparati campioni istopatologici per l'esame microscopico. Porzioni di BP impiantate in BPR 1-BPR 10 saranno asportate con tutta la fascia circostante, i tessuti dermici e muscolari. Le stesse procedure saranno eseguite anche nel gruppo PRR 11-PRR 20 e nel gruppo BPR 21-BPR 25. I campioni saranno fissati in formalina tamponata al 10%, tagliati e colorati con ematossilina ed eosina (H&E) per l'osservazione istologica.

Il dolore post-operatorio, come nell'uomo, sarà lieve, e sarà trattato con analgesici secondo tecniche standardizzate nell'uomo. Nella nostra esperienza, gli animali sottoposti a chirurgia protesica, sia il gruppo sperimentale che quello di controllo, saranno trattati con antibiotici profilattici e antidolorifici nell'immediato post-operatorio, e saranno attentamente monitorati.

Anche se nel modello animale, la sterilità di tutta la procedura chirurgica previene l'infiammazione, l'edema e la sepsi e gli ascessi e garantisce un basso livello di dolore postoperatorio. Nei giorni successivi all'intervento chirurgico è previsto un moderato appetito degli animali operati e lievi sintomi clinici legati al post-operatorio.

Tutti gli animali trattati saranno osservati giornalmente per controllare attentamente la quantità di cibo che verrà consumata e quindi la potenziale perdita di appetito. Si cercheranno evidenze di possibili processi infiammatori e degenerativi a carico della cute della parete addominale, sintomi di infezione o rigetto della protesi. Se la perdita di peso sarà eccessiva (ad es. più del 10% del peso normale di un animale della stessa razza, della stessa età e rispetto al gruppo di controllo), o l'animale mostrerà sintomi clinici di sofferenza più di un normale postoperatorio , sarà sottoposto ad anestesia generale e poi eliminato.

La terapia analgesica e antibiotica eseguita nel periodo postoperatorio sarà la seguente:

Antibiotico: enrofloxacina 2,5 mg/kg/die i.m. per 5-7 giorni; e analgesico antinfiammatorio: ketoprofene, Findol 10%, 0,3 ml/10 kg/die i.m. per 3-5 giorni. Se necessario verrà somministrato anche tramadolo, 2-4 mg/kg/die nei primi 2/3 giorni post-intervento. La ferita chirurgica verrà controllata giornalmente.

I parametri chimico-clinici esaminati su campioni di sangue da 3 ml saranno: BUN (Blood Urea Nitrogen), glicemia, creatinina, sodio, potassio, calcio, magnesio, albumina, proteinemia totale e livello di proteine ​​nel sangue, SGOT (Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase ), SGPT (siero glutammico piruvato transaminasi), GGT (gamma glutamil transferasi), ALP (fosfatasi alcalina) e bilirubina frazionata, PT (tempo di protrombina), APTT/PTT (tempo di tromboplastina parziale attivata), fibrinogeno, formula CBC (emocromo completo). , sottopopolazioni linfocitarie, proteina C-reattiva, velocità di eritrosedimentazione.

Verrà eseguito esame ecografico per valutare morfologicamente l'incorporazione della protesi, la formazione di sieromi, lividi, ascessi. Questa procedura verrà eseguita sotto sedazione e seguita dal controllo del peso corporeo e dal prelievo di un campione di sangue. La stessa procedura verrà ripetuta due volte all'intervento e dopo 35 giorni al sacrificio.