„BP jako nowe urządzenie w chirurgii i leczeniu nowotworów litych i nowotworów układu krwiotwórczego. Efekty implantacji BP” (DM159)

Buckypaper (BP) to innowacyjny materiał, który przyciągnął uwagę wielu grup badawczych zaangażowanych w badanie jego możliwych zastosowań w różnych dziedzinach technologicznych poprzedzających eksperymenty na ludziach. W rzeczywistości eksperymenty, przeprowadzone wstępnie na modelu zwierzęcym, będą miały zastosowanie na ludziach, jeśli wyniki pod względem toksyczności i trwałości będą zadowalające.

Interesujące właściwości materiału, takie jak dobra wytrzymałość mechaniczna, przewodność elektryczna, niska gęstość, możliwość dostosowania porowatości, są ściśle związane z wewnętrznymi właściwościami nanorurek węglowych (CNT), z których wykonany jest BP. Wysokie rozwinięcie powierzchni CNT, oprócz promowania ich agregacji, pozwala na przygotowanie mikro- i nanoporowatych membran, które wykluczają przejście cząstek koloidalnych o średnicy większej niż 50 nm. Mikroporowata struktura zapewnia również BP wysoką zdolność wchłaniania cieczy, takich jak woda, dla której efekt kapilarności szybko przenika w materiał siatkowy. Może to być możliwą interpretacją szybkiej i skutecznej adhezji BP do tkanek biologicznych obserwowanej w naszych badaniach nad wpływem materiału wszczepionego in vivo. Bioadhezja BP została udokumentowana w doświadczeniach ex vivo złuszczania mechanicznego (chirurgia na stole), przeprowadzonych z wyprzedzeniem przy użyciu jako podłoża świnek morskich, szczurów, powięzi mięśni brzucha królików. Wyniki pokazały, że siła wymagana do umieszczenia BP z podpory organicznej jest znacznie większa niż ta wymagana w przypadku konwencjonalnej protezy wykonanej z sieci polimerowych, powszechnie stosowanej w chirurgii przepukliny, mocowanej za pomocą kleju oraz bioadhezyjnego syntetycznego materiału protetycznego dostępnego obecnie na rynku. Opierając się na tych ocenach i potencjale oferowanym przez zastosowanie BP w dziedzinie chirurgii protetycznej, w ramach tego projektu oczekuje się dalszych badań w celu opracowania nowej generacji materiałów protetycznych do użytku BP oparte na chirurgii, łatwe do wszczepienia przez chirurga bez potrzeby stosowania szwów, wykresów i/lub klejów biologicznych. Przyczyny są następujące:

1. szwy: mogą zaciskać węzły naczyniowe (niedokrwienie-zanik) lub nerwy (przewlekły ból);
2. wykresy: umieszczanie ślepych i może powodować krwawienie lub ból;
3. kleje biologiczne: pochodzące z osocza dawców, a zatem mogą przenosić nieznane choroby.

Nadal nie wiadomo, czy BP ma odpowiednie właściwości mechaniczne, aby wytrzymać naprężenia występujące na ścianie jamy brzusznej. W każdym razie udokumentowana jest dobra bioadhezja do żywych tkanek i preparatów anatomicznych, ale tylko wtedy, gdy jest wilgotna.

Z tego powodu zdecydowano się na przygotowanie materiałów kompozytowych BP/polipropylen. Takie materiały, określane jako „sprzężone”, będą otrzymywane przez przyleganie do gładkiej powierzchni BP polimerowego podłoża, które nadaje warstwie hybrydowej odpowiednią odporność mechaniczną. Taki system może podlegać dalszym zmianom. Rzeczywiście, wykorzystując grupy funkcyjne obecne lub wprowadzone do struktury krystalicznej MWCNT i/lub polimeru, możliwe będzie wszczepienie materiału kompozytowego na powierzchnię mięśnia/powięzi mięśniowej w celu uzyskania przyczepności. Ponadto do struktury krystalicznej MWCNT można wprowadzić biologicznie aktywne cząsteczki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, przeciwadhezyjnym, przeciwzapalnym lub przeciwbólowym, w celu modulowania odpowiedzi zapalnej i włączania wszczepionego materiału do włóknistej blizny.

Celem tego projektu jest uzyskanie wyników, które mogą ukierunkować poszukiwania ostatecznej realizacji urządzenia protetycznego do zastosowania w chirurgii jamy brzusznej, nadającego się do zastosowania u ludzi.

Nasza Grupa Badawcza proponuje, aby obecny program badawczy posiadał wszystkie umiejętności potrzebne do osiągnięcia wszystkich celów.

Skupia badaczy o udowodnionej wiedzy i doświadczeniu w różnych dziedzinach Chirurgii Ogólnej i Chirurgii Protetycznej jamy brzusznej oraz Doświadczonego naukowca w dziedzinie Inżynierii Materiałowej, zwłaszcza polimerowej, również do zastosowań biomedycznych, Chemii Organicznej i syntezy biokoniugatów do opracowywania systemy powolnego uwalniania leków, charakterystyka układów biologicznych za pomocą technik magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Chirurg w jednostce poszukiwawczej faktycznie od wielu lat zajmuje się zarówno rozwiązywaniem zagadnień związanych z technikami chirurgicznymi, zarówno oceną wpływu na organizm żywy konwencjonalnych materiałów protetycznych, jak i innowacyjnych, w proponowanym projekcie , w tym poprzez testy in vivo, przeprowadzone zgodnie z protokołem specjalnie przygotowanym i zatwierdzonym przez Ministerstwo Zdrowia.

Protokół sporządzono w odniesieniu do polityki środowiskowej i zasad etycznych dotyczących eksperymentów na modelach zwierzęcych, zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej (86/609/EWG-Europejska Wspólnota Gospodarcza) i włoskiej ustawy nr 116/ 92.

Przeprowadzone zostaną systematyczne doświadczenia na 30 samicach królika nowozelandzkiego (R1-R30) o wadze około 3000 g (Harlan Laboratories). Badania "in vivo" dotyczyć będą biokompatybilności i adhezji BP w bliźnie brzusznej oraz w wykonywaniu zabiegów interwencyjnych przepukliny pooperacyjnej i chirurgii plastycznej przepukliny pachwinowej.

Biozgodność BP zostanie zbadana za pomocą testów biochemicznych krwi. Próbki krwi po 3 ml pełnej krwi zostaną pobrane od każdego zwierzęcia po indukcji znieczulenia ogólnego, z żyły usznej, przed operacją wszczepienia implantu protetycznego oraz przed eutanazją, jak wskazano w Harmonogramie.

Metodologia i technika eksperymentu:

Eksperymenty te są wstępne dla ludzi i zostaną przeprowadzone w znieczuleniu ogólnym z intubacją dotchawiczą, następnie usunięciem włosów, dezynfekcją i przygotowaniem pola operacyjnego. Wykonane zostanie nacięcie w linii środkowej około 10 cm pępka-łona, rozciągnięcie skóry i warstw podskórnych, następnie zostanie nacięta płaszczyzna powięzi i mięśnie głębokie, aby wejść do worka otrzewnej. Wykonanie pobrania krwi jednocześnie z pomiarem masy ciała oraz wykonanie USG okolicy brzusznej w celu zbadania miejsca implantacji w poszukiwaniu cech sepsy i przepukliny pooperacyjnej.

Będziemy wszczepiać ludziom tego rodzaju nowe materiały, ale wcześniej spróbujemy zbadać tolerancję i toksyczność na tak narysowanym modelu zwierzęcym: 2x2cm2 próbki BP (Buckypaper) i dziesięć królików otrzymają 2x2cm2 próbki PR (polipropylenu) (PRR11-PRR20) do kieszeni utworzonej pomiędzy powięzią mięśniową a dużymi mięśniami ściany brzucha. U pięciu królików (BPR21-BPR25) nacięcie chirurgiczne zostanie wykonane na linii białej brzucha i wykonane głęboko, w celu wejścia do jamy brzusznej. Grupa kontrolna (R26-R30) nie będzie poddawana zabiegowi.

Następnie zostanie wprowadzona próbka BP o powierzchni 2x2 cm2, szorstką stroną skierowaną w stronę powierzchni otrzewnej ściennej, a gładką i błyszczącą powierzchnią w stronę otrzewnej trzewnej (BPR21-BPR25). Pięć królików (R26-R30) nie będzie operowanych, ale zostaną użyte jako grupa kontrolna. Zwierzęta będą codziennie monitorowane i kontrolowane przez cały badany okres w celu ciągłej oceny ich stanu zdrowia i masy ciała. W 35 dniu zostanie pobrana próbka krwi do badania. Na koniec zwierzęta zostaną uśmiercone w znieczuleniu ogólnym.

Przypadki BPR1-BPR10 (grupa A) zostaną porównane z PRR11-PRR20 (grupa kontrolna B) porównując efekty implantów BP i tej samej wielkości w Parietene już stosowanych w chirurgii rekonstrukcyjnej zdrowego człowieka. Po interwencji, która potrwa około 60 minut od momentu indukcji, zwierzę będzie powoli wybudzane, a następnie wprowadzane z powrotem do pomieszczenia mieszkalnego.

W czasie składania ofiary zostaną przygotowane próbki anatomiczne wszystkich wnętrzności i miejsca implantacji, które zostaną zbadane histologicznie. Zostaną przygotowane próbki histopatologiczne do badań mikroskopowych. Części BP wszczepione w BPR 1-BPR 10 zostaną wycięte wraz ze wszystkimi otaczającymi tkankami powięziowymi, skórnymi i mięśniowymi. Te same procedury będą wykonywane również w grupie PRR 11-PRR 20 i BPR 21-BPR 25. Próbki zostaną utrwalone w 10% buforowanej formalinie, pocięte i wybarwione hematoksyliną i eozyną (H&E) do obserwacji histologicznej.

Ból pooperacyjny, podobnie jak u człowieka, będzie łagodny, leczony będzie środkami przeciwbólowymi według technik standaryzowanych u ludzi. Z naszego doświadczenia wynika, że ​​zwierzęta poddawane zabiegom protetycznym, zarówno grupa doświadczalna, jak i kontrolna, będą leczone profilaktycznie antybiotykami i lekami przeciwbólowymi bezpośrednio po zabiegu i będą pod ścisłą obserwacją.

Nawet na modelu zwierzęcym sterylność całego zabiegu chirurgicznego zapobiega stanom zapalnym, obrzękom, posocznicy i ropniom oraz zapewnia niski poziom bólu pooperacyjnego. W kolejnych dniach po zabiegu chirurgicznym należy spodziewać się umiarkowanego apetytu operowanych zwierząt i łagodnych objawów klinicznych związanych z okresem pooperacyjnym.

Wszystkie leczone zwierzęta będą codziennie obserwowane, aby dokładnie kontrolować ilość pokarmu, który zostanie spożyty, a tym samym potencjalną utratę apetytu. Będzie szukać śladów ewentualnych procesów zapalnych i zwyrodnieniowych skóry ściany brzucha, objawów infekcji lub odrzucenia protezy. Jeżeli utrata masy ciała będzie nadmierna (np. ponad 10% normalnej wagi zwierzęcia tej samej rasy, w tym samym wieku i w porównaniu z grupą kontrolną) lub zwierzę będzie wykazywać kliniczne objawy cierpienia pooperacyjnego bardziej niż normalnie , zostaną poddane znieczuleniu ogólnemu, a następnie usunięte.

Terapia przeciwbólowa i antybiotykoterapia w okresie pooperacyjnym będzie następująca:

Antybiotyk: enrofloksacyna 2,5 mg/kg/dobę im. przez 5-7 dni; i przeciwzapalne przeciwbólowe: ketoprofen, Findol 10%, 0,3 ml/10kg/d.i.m. przez 3-5 dni. W razie potrzeby zostanie podany również tramadol, 2-4 mg/kg/dobę w ciągu pierwszych 2-3 dni po interwencji. Rana chirurgiczna będzie sprawdzana codziennie.

Parametry kliniczno-chemiczne badane z próbek krwi o objętości 3 ml będą następujące: BUN (azot mocznikowy we krwi), glukoza we krwi, kreatynina, sód, potas, wapń, magnez, albumina, poziom białka całkowitego i białka we krwi, SGOT (transaminaza glutaminowo-szczawiooctowa w surowicy) ), SGPT (transaminaza glutaminianowo-pirogronianowa w surowicy), GGT (gamma-glutamylotransferaza), ALP (fosfataza alkaliczna) i frakcjonowana bilirubina, PT (czas protrombinowy), APTT/PTT (czas częściowej tromboplastyny ​​po aktywacji), fibrynogen, wzór CBC (pełna morfologia krwi) , subpopulacje limfocytów, białko C-reaktywne, szybkość sedymentacji erytrocytów.

Zostanie wykonane badanie ultrasonograficzne w celu oceny morfologicznej wbudowania protezy, powstawania seroma, siniaków, ropni. Ta procedura zostanie przeprowadzona w sedacji, po czym nastąpi kontrola masy ciała i pobranie próbki krwi. Ta sama procedura zostanie powtórzona dwukrotnie przy interwencji i po 35 dniach przy uśmierceniu.