La produzione di specie reattive dell'ossigeno in risposta all'integrazione di glutatione e all'esercizio acuto (DIMITOS)

Produzione di ROS in risposta alla supplementazione di glutatione:

Oggi, 387 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di T2D e si prevede che questo numero aumenterà a 592 milioni nel 2035. Il muscolo scheletrico è responsabile di circa il 75% dell'assorbimento totale di glucosio, rendendo il muscolo scheletrico il tessuto quantitativamente più importante quando si tratta di insulino-resistenza (1). È stato suggerito che lo stress ossidativo possa rappresentare un possibile fattore causale nella fisiopatologia dell'insulino-resistenza del muscolo scheletrico. Il legame tra ROS e insulino-resistenza del muscolo scheletrico è stato stabilito sia in vitro che in vivo (2, 3), ma pochi studi hanno effettivamente misurato la produzione di ROS nel muscolo scheletrico dei pazienti con T2D (4-6). I mitocondri sono una fonte di ROS e anche uno dei principali bersagli del danno ossidativo (7). Il sistema di difesa mitocondriale contro lo stress ossidativo si basa su antiossidanti endogeni. Il glutatione (GSH) è l'antiossidante endogeno più abbondante nella cellula e, quindi, un protettore cruciale contro lo stress ossidativo e la resistenza all'insulina (8). A sostegno di ciò, i pazienti con T2D hanno un livello ridotto di GSH e un livello aumentato di GSH ossidato (GSSG) nel plasma (9) e i soggetti insulino-resistenti hanno un'aumentata produzione mitocondriale di ROS e un ridotto rapporto GSH/GSSG nel muscolo scheletrico rispetto ai controlli sani (3). Inoltre, è stato riscontrato che l'infusione di 1 ora di glutatione aumenta l'assorbimento di glucosio nei pazienti con T2D di circa il 25% e migliora l'ambiente redox, come evidenziato da un aumento del rapporto GSH/GSSG nel plasma; effetti che non sono stati osservati nei controlli sani (10). L'effetto dell'integrazione orale prolungata di GSH sulla sensibilità all'insulina del muscolo scheletrico e sulla produzione mitocondriale di ROS nei pazienti con T2D, a nostra conoscenza, non è mai stato studiato.

Domande della ricerca 1: L'integrazione orale di GSH migliora la sensibilità all'insulina del muscolo scheletrico nei pazienti con T2D e nei controlli sani? E se è così, questo effetto può essere collegato a uno stato redox più benefico nella cellula muscolare? Ipotesi: l'integrazione orale di GSH migliorerà la sensibilità all'insulina del muscolo scheletrico nei pazienti con T2D e questo effetto sarà collegato a una ridotta produzione mitocondriale di ROS nel muscolo scheletrico.

Produzione di ROS in risposta all'esercizio acuto:

L'esercizio acuto induce un marcato aumento della trascrizione del coattivatore-1α del recettore γ attivato dal proliferatore del perossisoma (PGC-1α) (11), e pertanto si ritiene che PGC-1α svolga un ruolo chiave nella biogenesi mitocondriale indotta dall'allenamento (12 ). La contrazione delle cellule muscolari scheletriche di ratto aumenta la produzione di ROS e l'espressione dell'mRNA di PGC-1α, ma in presenza di antiossidanti, la produzione di ROS è ridotta e l'aumento dell'mRNA di PGC-1α è abolito (13). Inoltre, l'esercizio combinato con allopurinolo (un inibitore della produzione di ROS) attenua notevolmente l'entità dell'aumento dell'mRNA di PGC-1α indotto dall'esercizio nei ratti, rispetto al solo esercizio (14). Questi risultati suggeriscono che PGC-1α, almeno in parte, è regolato attraverso un meccanismo che coinvolge i ROS. Inoltre, è stato suggerito che i ROS regolano PGC-1α attraverso l'attivazione della protein chinasi attivata da AMP (AMPK) (15). È interessante notare che i soggetti con insulino-resistenza hanno una ridotta attività AMPK stimolata dall'esercizio, rispetto ai controlli magri (16, 17), che potrebbe spiegare l'attenuata biogenesi mitocondriale indotta dall'allenamento osservata in alcuni pazienti con T2D (5, 17, 18), ma non tutti (19). Non è noto se la produzione di ROS sia implicata in una risposta di allenamento anormale. La nostra attuale conoscenza dei ROS in risposta all'esercizio acuto deriva da studi su animali e cellule e nessuno studio, a nostra conoscenza, ha indagato il legame tra ROS e biogenesi mitocondriale nei pazienti con T2D in risposta all'esercizio acuto.

Domande di ricerca 2: L'aumento della produzione di ROS indotto dall'esercizio richiesto per una risposta di biogenesi mitocondriale differisce tra i pazienti con T2D e i controlli sani? In tal caso, l'esercizio a bassa intensità riduce la produzione transitoria di ROS e quindi determina una maggiore risposta della biogenesi mitocondriale nei pazienti con T2D, rispetto all'esercizio ad alta intensità? Ipotesi: Considerando la condizione patologica del muscolo scheletrico T2D (es. alto livello cronico di ROS), si ipotizza che una minore intensità di esercizio, che porta a una minore produzione di ROS stimolata dall'esercizio, sia uno stimolo più ottimale (es. non troppo elevato) per la biogenesi mitocondriale nei pazienti con T2D.

Materiale e metodologia:

20 pazienti con T2D (non insulino-dipendenti) e 20 controlli sani saranno reclutati nello studio. I due gruppi saranno abbinati per età, peso e consumo massimo di ossigeno (VO2 max).

Approccio per lo studio: Lo studio è uno studio controllato con placebo, randomizzato, in doppio cieco.

Ad ogni frequenza al laboratorio (escluso il giorno dello screening), i soggetti sono invitati a:

• Riferire al laboratorio a digiuno notturno
• Astenersi dall'alcool e dall'attività fisica 24 ore prima di ogni giorno di studio.
• Ripetere la stessa dieta prescritta dal questionario di richiamo dietetico di 24 ore allegato (ai soggetti viene anche chiesto di compilare un questionario di richiamo dietetico di 24 ore alla loro prima visita al laboratorio)

Screening: prima che i soggetti vengano inclusi nello studio, verrà condotto un esame clinico standard, compresa la storia medica, l'emoglobina glicata (HbA1c) e l'ECG.

Se inclusi nello studio, i soggetti vengono sottoposti a 3 giorni sperimentali prima e dopo l'intervento.

Prova giorno 1:

• Dual Energy X-ray Absorptiometry-scan per misurare la composizione corporea,
• Test di esercizio incrementale per determinare l'intensità dell'esercizio che suscita la massima ossidazione dei grassi (Fatmax test)
• Test da sforzo incrementale fino ad esaurimento per determinare il VO2 max.

Prova giorno 2:

• Biopsie muscolari del vasto laterale (basale, subito dopo la cessazione dell'esercizio e dopo 90 minuti di recupero)

• Prove da sforzo acuto su cicloergometri al 70% del VO2 max (intensità moderata) o al 50% del VO2 max (bassa intensità). I due test di esercizio saranno abbinati per la quantità totale di lavoro (kJ).

  10 soggetti con T2D e 10 soggetti di controllo vengono randomizzati a ciascun test da sforzo.

Prova giorno 3:

• Misurazione del tasso metabolico a riposo mediante calotta (basale e durante il clamp)
• Test di tolleranza al glucosio endovenoso
• Morsetto euglicemico iperinsulinemico

Dopo i giorni sperimentali, i soggetti vengono randomizzati in placebo o supplementazione di GSH e istruiti a consumare 1000 mg di GSH/giorno o placebo al giorno (2 compresse al mattino e 2 compresse alla sera) per 4 settimane.

Considerazioni statistiche:

Il confronto dei gruppi o degli interventi sarà eseguito utilizzando un test ANOVA unidirezionale o bidirezionale con misure ripetute, a seconda dei casi. Sulla base della variazione mostrata negli studi precedenti, una potenza prevista dell'80% e un livello di significatività di P