注意欠陥/多動性障害 (ADHD) の候補遺伝子スクリーニング

出典: 東州大学付属西京病院および小児病院のサンプルバンク。サンプルの形態: 全血。推定サンプル数: 年齢、性別が一致する健康な対照の ADHD 患者 100 名。症例除外基準：あらゆる種類の精神神経疾患、IQ値が70未満。

研究プロトコル:

1. Qiagen キットを使用して 200 マイクロリットルの血液からゲノム DNA を抽出します。 (1) 凍結した血液を室温で溶かす。 （２）０．２ｍｌの血液を滅菌抗凝固遠心管に取り、等量のＰＢＳリン酸緩衝液を加え、完全に混合した後、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄する。 （３）６６．７ＬのＳＴＥ２．４Ｌ、２０％ＳＤＳ、３７℃の水浴１時間； （４）プロテアーゼＫプラス１ ２０ｍｇ／ｍｌ混合物、５５℃の水浴で一晩（１０〜１４時間）消化。 （５）消化されたサンプルをトリス飽和フェノールで処理し、よく振盪し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。 (6) 上部の水相を滅菌遠心管に移す。一定量のトリス飽和フェノールを加え、よく振盪し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。 （７）上部の水相を別の滅菌遠心管に移し、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えた。 渦の振動を十分に混合し、12000rpmで10分間遠心分離しました。 （８）上部の水相を別の滅菌遠心管に移し、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を加え、十分に振動させて混合し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。 （９）上清を別の滅菌遠心管に移す。 ２倍量のエタノールを加え、酢酸ナトリウムの１／１０量レベルで、ＤＮＡの綿状沈殿が見えるまで振盪する。 （１０）サンプルを−２０℃の冷凍冷蔵庫に３０分間置くか、または氷浴に１５〜２０分間置き、取り出した後、再度１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させる。 (11) ガンヘッドは DNA を別の滅菌遠心管に移し、70% エタノールで洗浄および振盪して不純物 DNA を洗い流します。 （１２）エタノール中、ＤＮＡを真空乾燥または自然乾燥させ、ＴＥ緩衝液を加えて溶解し、－２０℃で待機保存する。
2. 次のシーケンスの前に、UV 分光光度計で DNA 純度 260/280 が 1.8 (1.8 ± 0.05) に近く、濃度が 100 ng/μL 以上であることをテストします。
3. 抽出されたゲノム DNA は Sangon Biology Engineering Limited Company (上海) に送られ、ADHD リスク配列に関連する候補変異を見つけるために配列決定されます。 NIH 遺伝子データベースによると、NDRG2 の最長の転写物 (ID: 57447 遺伝子、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&struct=true) (合計17 個のエクソンと 16 個のイントロン、および遺伝子の 5'UTR および 3'UTR 領域の配列をアラインメントして、潜在的な突然変異を見つけます。
4. カイ二乗分析およびその他の統計的手法を使用して、突然変異と ADHD に対する感受性との関係を決定します。