Detección de genes candidatos para el trastorno por déficit de atención/hiperactividad (TDAH)

Fuente: Banco de muestras del Hospital de Xijing y del Hospital Infantil afiliado a la Universidad de Soochow; Forma de la muestra: Sangre total; Número estimado de muestras: 100 pacientes con TDAH y controles sanos emparejados por edad y sexo; Criterios de exclusión de casos: todo tipo de trastornos neuropsiquiátricos, valor de CI inferior a 70;

Protocolo de estudio:

1. Uso del kit Qiagen para extraer el ADN genómico de 200 microlitros de sangre. (1) derretir sangre congelada a temperatura ambiente; (2) tome la sangre de 0,2 ml en un tubo de centrífuga anticoagulante estéril, agregue un volumen igual de tampón de fosfato PBS, después de mezclar completamente la centrifugación a 12000 rpm durante 5 minutos, deseche el sobrenadante; (3) 66,7 L STE 2,4 L, 20 % SDS, baño de agua a 37 DEG C 1 h; (4) proteasa K más 1 mezcla de 20 mg/ml l, digestión en baño de agua a 55 DEG C durante la noche (10 ~ 14 h); (5) las muestras digeridas tratadas con fenol saturado de Tris, agitar bien, centrífuga de 12000 rpm durante 10 minutos; (6) la fase acuosa superior a un tubo de centrífuga estéril; añadiendo volumen de fenol saturado con Tris, agitar bien, centrífuga a 12000 rpm durante 10 min; (7) la fase acuosa superior se transfirió a otro tubo de centrífuga estéril, y se añadió un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1). La oscilación del vórtice se mezcló completamente y las 12000 rpm se centrifugaron a 10 minutos; (8) la fase acuosa superior se transfirió a otro tubo de centrífuga estéril, y se agregó un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), que se agitó completamente y se mezcló con centrifugación a 12000 rpm durante 10 min; (9) transferir el sobrenadante a otro tubo de centrífuga estéril; añadiendo 2 veces el volumen de etanol, el nivel de volumen de acetato de sodio 1/10 agitar, hasta que la precipitación floculante de ADN sea visible; (10) la muestra se coloca a -20 DEG C refrigerador congelador 30 min o baño de hielo durante 15 ~ 20 min, después de la eliminación de 12000 rpm centrífugo 10 min nuevamente, para que el ADN precipite; (11) la cabeza de la pistola recogerá el ADN en otro tubo centrífugo estéril, con una cantidad de etanol al 70 %, lavado y agitación, para eliminar las impurezas del ADN; (12) fuera de etanol, ADN por secado al vacío o secado natural, disolución de adición de tampón TE, -20 almacenado en espera.
2. El espectrofotómetro UV prueba la pureza del ADN de 260/280 cerca de 1,8 (1,8 ± 0,05), la concentración de 100 ng/μL o más antes de la siguiente secuenciación.
3. El ADN genómico extraído se enviará a Sangon Biology Engineering Limited Company (Shanghai) y se secuenciará para encontrar mutaciones candidatas relacionadas con la secuencia de riesgo del TDAH. Según la base de datos de genes NIH, la transcripción más larga de NDRG2 (ID: gen 57447, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&strand=true) (un total de 17 exones y 16 intrones y el gen 5 'UTR y la región 3' UTR) se alinearán las secuencias para encontrar posibles mutaciones.
4. Usando el análisis de chi cuadrado y otros métodos estadísticos para determinar la relación entre las mutaciones y la susceptibilidad al TDAH.