주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 후보 유전자 스크리닝

출처: 쑤저우 대학 부속 시징 병원 및 어린이 병원 샘플 뱅크; 샘플 형태: 전혈; 예상 샘플 수: ADHD 및 연령, 성별이 일치하는 건강한 대조군 환자 100명; 사례 제외 기준: 모든 종류의 신경 정신 장애, IQ 값이 70 미만;

연구 프로토콜:

1. Qiagen 키트를 사용하여 혈액 200마이크로리터의 게놈 DNA를 추출합니다. (1) 실온에서 동결된 혈액을 녹인다. (2) 0.2 ml의 혈액을 멸균 항응고 원심분리기 튜브에 넣고 동량의 PBS 인산염 완충액을 첨가하고 12000rpm 원심분리 5분 동안 완전히 혼합한 후 상층액을 버린다. (3) 66.7L STE 2.4L, 20% SDS, 37℃ 수조 1시간; (4) 프로테아제 K + 1 20mg/ml l 믹스, 55℃ 수조에서 밤새 분해(10 ~ 14h); (5) 트리스 포화 페놀로 처리된 분해된 샘플을 잘 진탕하고, 12000rpm 원심분리 10분; (6) 상부 수성상을 멸균 원심분리 튜브로 옮기는 단계; 트리스 포화 페놀의 부피를 첨가하고, 잘 진탕하고, 12000rpm 원심분리 10분; (7) 상부 수성상을 다른 멸균 원심분리기 튜브로 옮기고 동량의 페놀을 첨가하였다: 클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1). 와류의 진동을 완전히 혼합하고, 12000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다; (8) 상부 수성상을 또 다른 멸균 원심분리 튜브로 옮기고, 동량의 클로로포름을 첨가하였다: 이소 아밀 알코올(24:1), 이를 완전히 진동시키고 12000rpm 원심분리로 10분 동안 혼합하였다; (9) 상등액을 다른 멸균 원심분리기 튜브로 옮기고; 2배 부피의 에탄올을 첨가하고, DNA의 응집 침전물이 보일 때까지 아세트산나트륨의 1/10 부피 수준을 흔들고; (10) 샘플을 -20℃ 냉장고에서 30분 또는 얼음욕에서 15~20분 동안 두었다가 다시 12000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 DNA를 침전시킨다. (11) 건 헤드는 불순물 DNA를 세척하기 위해 70% 에탄올 세척 및 진탕의 양으로 DNA를 다른 멸균 원심 튜브로 선택합니다. (12) 에탄올 중, DNA를 진공 건조하거나 자연 건조하고, TE 완충액을 첨가하여 용해시키고, -20을 대기 상태로 보관하였다.
2. UV 분광 광도계는 260/280의 1.8(1.8 ± 0.05)에 가까운 DNA 순도를 테스트하고 다음 시퀀싱 전에 100ng/μL 이상의 농도를 테스트합니다.
3. 추출된 게놈 DNA는 Sangon Biology Engineering Limited Company(Shanghai)로 보내져 ADHD 위험 염기서열과 관련된 후보 돌연변이를 찾기 위해 염기서열이 분석됩니다. NIH 유전자 데이터베이스에 따르면, NDRG2의 가장 긴 전사체(ID: 57447 ​​유전자, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000014.9? Report=genbank&from=21016763&to=21070872&strand=true)(총 17개의 엑손 및 16개의 인트론 및 유전자 5'UTR 및 3'UTR 영역)은 잠재적인 돌연변이를 찾기 위해 정렬된 서열일 것이다.
4. 카이 제곱 분석 및 기타 통계적 방법을 사용하여 돌연변이와 ADHD에 대한 감수성 사이의 관계를 결정합니다.