バングラデシュにおけるカラアザールの治療のための多施設無作為化試験のためのキャパシティビルディングのためのパイロット研究

具体的な目的:

主な目的: バングラデシュでカラアザールの新しい治療法を評価する能力を開発すること。

副次的な目的:

1. 血清中の rK39 ディップスティック テストを含む、カラ アザールの新しい診断テストを評価する。尿中のKATEX;血液および臨床サンプル中のPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）。
2. 血液サンプルと臨床サンプルで PCR を使用して、28 回の SAG 注射による治療に対する反応を評価する。
3. ミニエクソン PCR-RFLP 技術を ICDDR,B に移し、マイメンシン地域で最も流行しているリーシュマニア種と SAG による標準治療に対するそれらの反応を特徴付ける。
4. また、特定の遺伝子型が PKDL の発生に関連しているかどうか、およびミニエクソン PCR がリーシュマニア種の種内および種間の遺伝的進化を監視するための適切なマーカーであるかどうかも分析します。

研究デザインと方法:

提案された研究の患者は、これらの地域で活動している政府機関との協議により、マイメンシンの 3 つのウパジラ健康複合施設から選ばれました。 必要に応じて、研究に必要な数の被験者を登録するために積極的な監視を行います。

忍耐

合計で、以下の KA の診断基準を満たす連続した 200 例 (5 歳以上) が研究に登録されました。(i) 2 週間を超える発熱。 (ii) 以下の基準の少なくとも 1 つ - 脾腫、皮膚の黒ずみ、および体重減少。 (iii) 正の rK39 ディップスティック テスト。 除外基準には、(1) 5 歳未満の子供、(2) 妊娠中の女性、および (3) カラアザールとは関係のない他の深刻な病気を同時に患っている患者が含まれます。 上記の基準を満たす患者（または未成年者の場合はその両親/保護者）は、専門医によるSAGによる治療のリスクと脾臓吸引手順に伴うリスクについて説明されました. インフォームド コンセント (口頭または書面) は、研究に含める前に、患者 (または未成年者の場合はその両親/保護者) から得られました。 同じ地域に住んでいる 100 人の健康な個人が、PCR およびその他の KA の診断テストを評価するためのコントロールとして登録されました。 私たちのフィールド ワーカーは地域の家々を訪問し、インフォームド コンセントを得た健康なボランティアから血液サンプルを採取します。

研究手順と評価

脾臓吸引:

脾臓吸引は、陽性のrK39ディップスティック検査でKAの臨床的特徴を呈した200人の連続した患者で行われました。 研究1日目に診断を確認するために脾臓吸引を行い、その後29日目に病気の治癒を評価するために再度脾臓吸引を行った。 したがって、被験者がrK39ディップスティック検査で陽性であることが判明した場合、脾臓吸引などの標準的な事前手順検査が行われます。 ヘモグロビンの推定、出血時間、凝固時間、および血小板数が実行されました。 脾臓吸引は、重度の貧血 (Hb ≥ 6 mg/dl) ではなく、血小板数が 50,000/マイクロ リットル以上の患者にのみ実施されました。 脾臓吸引の前にプロトロンビン時間もチェックされ、PTが4秒以上延長されたものは研究に適格ではありませんでした。 処置後の出血の場合には、輸血を含むすべての必要な治療が提供されました。 必要に応じて、患者はマイメンシン医科大学病院に移送され、より専門的な治療とサポートを受けます。

治療とフォローアップ

バングラデシュでは、グルコン酸アンチモンナトリウム (SAG; Albert David Ltd.、インド) を 20 mg/kg 体重、最大用量 850 mg/日で 28 日間筋肉内投与することが現在の標準治療です。 KA患者向け。 この治療期間中、脈拍数、呼吸数、血圧、体温を 12 時間間隔で監視しました。 臨床的に必要な場合は、心電図を実施しました。 重度の毒性（心毒性、腎不全など）の兆候が現れた場合、治療は中止され、患者は標準用量のアムホテリシン B で治療されていました。

入院：治療中のすべての患者は、SAGによる治療の全期間、地域に根ざした医科大学病院に滞在するよう提案されました。 患者は、治療の失敗またはSAGによる毒性の場合に備えて、アムホテリシンBによる治療のために入院していました。

フォローアップ: 治療の最後に、患者は身体診察と脾臓吸引によって治癒を評価されました。 被験者は、スキーム 2 に示すように 6 か月間追跡されました。

評価される診断テスト

rK39 ディップスティック試験 rK39 ディップスティック試験のために、毛細管に指刺し血液検体を採取しました。 この方法は迅速で時間を節約できます。

寄生虫診断

寄生虫学的診断には脾臓吸引物を使用した。 脾臓吸引物のスライドをギムザ染色用に準備しました。 ICDDR,B の 2 人のラボ技術者は、染色技術とスライドの読み方について訓練を受けました。 無作為に選択されたスライドは、品質管理のために他の場所の参照ラボに送られていました。

ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)

採取した血液サンプル中の Leishmania donovani の DNA は、Salotra らによって記述された方法を使用して検出されていました。

サンプルの収集と DNA の分離: 収集された血液標本は、ICDDR,B の寄生虫学研究所に運ばれ、4°C に移され、ほぼ同じ日に処理されました。 ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｂｌｏｏｄ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて０．２ｍｌの血液からＤＮＡを抽出した。

PCR 増幅: 培養寄生虫 (1 ng) および臨床サンプル (100 ng) からの DNA を、上記の LdI プライマーを使用した増幅のために採取しました。 反応混合物 (50 µl) には、10 mM Tris-HCl (pH 8.3)、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、200 µM 濃度の各デオキシヌクレオシド三リン酸、50 ng の各プライマー、および 1.25 U の Taq DNA ポリメラーゼ (Gibco BRL ）。 各反応混合物を鉱油で覆い、94℃で 1 分間の変性、45℃で 1 分間のアニーリングを 40 サイクルプログラムしたサーマルサイクラー (Perkin-Elmer、ウォリントン、イギリス) で増幅を行いました。 94°Cで2分間の初期変性が先行する72°Cで2分間の伸長。 最終伸長は、72℃で 3 分間でした。 生成物は、臭化エチジウム (0.5 μg/ml) を TAE バッファー (0.04 M 酢酸トリス、0.001 M EDTA) に含む 1% アガロースゲルで電気泳動により分析し、UV 照明下で撮影しました。

ミニエクソン PCR-RFLP: ミニエクソン PCR-RFLP は、スイス熱帯研究所 (STI) によって開発されました (Marfurth et al. 2003)。

サンプルサイズの計算と結果変数:

200 のケースと 100 のコントロールのサンプル サイズは、能力開発の主な目的を満たすための実際的な考慮事項に基づいており、研究は仮説検定のために正式に強化されていません。 新しい診断テストの感度と特異性を調査するための重点は、記述統計と信頼区間を提示することにあります。

データ分析：

感度 (正しく識別された真の陽性結果の割合) と特異度 (正しく識別された真の陰性結果の割合) は、診断テストごとに計算され、これらの割合の 95% 信頼区間はウィルソン法を使用して計算されました。

陽性および陰性の予測値も、Altman らによって記述された方法を使用して計算されました。 陽性適中率は、実験的診断検査で陽性の結果が得られ、寄生虫学的検査によって正しく診断された患者の割合です。 同様に、陰性適中率は、寄生虫学的検査によって正しく診断された陰性の診断検査結果を有する患者の割合です。 陽性および陰性の予測値の 95% CI が決定されました。 これらのパラメーターにより、各診断テストと「ゴールド スタンダード」の寄生虫学的検査との比較が可能になります。