Un estudio piloto para el desarrollo de capacidades para un ensayo aleatorizado multicéntrico para el tratamiento de Kala Azar en Bangladesh

Objetivos específicos:

Objetivo principal: desarrollar la capacidad para evaluar regímenes más nuevos para el tratamiento del kala azar en Bangladesh.

Objetivos secundarios:

1. Evaluar nuevas pruebas de diagnóstico para kala azar, incluida la prueba de tira reactiva rK39 en suero; KATEX en orina; y PCR (reacción en cadena de la polimerasa) en sangre y muestras clínicas.
2. Evaluar la respuesta al tratamiento con 28 inyecciones de SAG mediante PCR en muestras de sangre y muestras clínicas.
3. Transferir la técnica mini-exon PCR-RFLP a ICDDR,B y caracterizar las especies de Leishmania más prevalentes en el área de Mymensingh y su respuesta al tratamiento estándar con SAG.
4. También analizaremos si ciertos genotipos están asociados con la aparición de PKDL y si la PCR mini-exón es un marcador adecuado para monitorear la evolución genética intra e interespecies de las especies de Leishmania.

Diseño y métodos de investigación:

Los pacientes para el estudio propuesto fueron seleccionados de tres complejos de salud upazilla en Mymensingh por discusión con las agencias gubernamentales que trabajan en estas áreas. Si es necesario, optaríamos por la vigilancia activa para inscribir el número requerido de sujetos para el estudio.

Pacientes

En total, se inscribieron en el estudio 200 casos consecutivos (edad >5 años) que cumplían los siguientes criterios de diagnóstico de KA: (i) fiebre durante >2 semanas; (ii) al menos uno de los siguientes criterios: esplenomegalia, oscurecimiento de la piel y pérdida de peso; y (iii) una prueba de tira reactiva rK39 positiva. Los criterios de exclusión incluirán: (1) niños menores de cinco años, (2) mujeres embarazadas y (3) pacientes que padezcan simultáneamente cualquier otra enfermedad grave que no esté relacionada con el kala azar. Los pacientes (o sus padres/tutores en el caso de menores) que cumplieran los criterios anteriores, fueron explicados sobre el riesgo del tratamiento con SAG y el riesgo que implican los procedimientos de aspiración esplénica por parte de médicos expertos. A continuación, se obtuvo el consentimiento informado (verbal o escrito) de los pacientes (o de sus padres/tutores en el caso de menores) antes de su inclusión en el estudio. Se inscribieron cien individuos sanos que vivían en la misma área como controles para evaluar PCR y otras pruebas de diagnóstico de KA. Nuestros trabajadores de campo visitaron las casas de la comunidad y recolectaron muestras de sangre de los voluntarios sanos con su consentimiento informado.

Procedimientos de estudio y evaluaciones

Aspiración esplénica:

La aspiración esplénica se realizó en 200 pacientes consecutivos que habían presentado características clínicas de KA con una prueba de tira reactiva rK39 positiva. Se realizó una aspiración esplénica para confirmar el diagnóstico el día 1 del estudio y luego nuevamente el día 29 para evaluar la curación de la enfermedad. Por lo tanto, cuando se encontró que un sujeto era positivo mediante la prueba de tira reactiva rK39, las pruebas estándar previas al procedimiento para la aspiración esplénica, p. Se realizó estimación de hemoglobina, tiempo de sangrado, tiempo de coagulación y conteo de plaquetas. La aspiración esplénica se realizó solo en aquellos que no estaban severamente anémicos (Hb ≥ 6 mg/dl) y tenían recuentos de plaquetas > 50.000/microlitro de sangre. El tiempo de protrombina también se controló antes de la aspiración esplénica y aquellos con un PT prolongado de más de 4 segundos no fueron elegibles para el estudio. Se proporcionó todo el tratamiento necesario en caso de hemorragia posterior al procedimiento, incluida la transfusión de sangre. Si es necesario, los pacientes también serán transportados al Mymensingh Medical College Hospital, para un tratamiento y apoyo más especializado.

Tratamiento y seguimiento

En Bangladesh, la administración intramuscular de gluconato de sodio y antimonio (SAG; Albert David Ltd., India), en una dosis de 20 mg/kg de peso corporal, con una dosis máxima de 850 mg/día, durante veintiocho días es el tratamiento estándar actual para pacientes con AR. El pulso y las frecuencias respiratorias, la presión arterial y la temperatura se controlaron a intervalos de 12 horas durante este período de tratamiento. Se realizaron electrocardiogramas si estaba clínicamente indicado. El tratamiento se suspendió si se desarrollaban signos de toxicidad grave (cardiotoxicidad, insuficiencia renal, etc.) y el paciente había sido tratado con dosis estándar de anfotericina B.

Hospitalización: A todos los pacientes en tratamiento se les ofreció permanecer en el Community-based Medical College Hospital durante todo el período de tratamiento con SAG. Los pacientes habían sido hospitalizados para tratamiento con anfotericina B en caso de fracaso del tratamiento o toxicidad con SAG.

Seguimiento: Al final del tratamiento, se evaluó la curación de los pacientes mediante examen físico y aspiración esplénica. Los sujetos habían estado siguiendo durante seis meses como se muestra en el Esquema-2.

Pruebas diagnósticas a evaluar

Prueba de tira reactiva rK39 Se recolectó una muestra de sangre por punción digital en tubos capilares para la prueba de tira reactiva rK39. Este método es rápido y ahorra tiempo.

Diagnóstico parasitológico

El aspirado esplénico se utilizó para el diagnóstico parasitológico. Se preparó un portaobjetos de aspirados esplénicos para la tinción con Giemsa. Se capacitó a dos técnicos de laboratorio de ICDDR,B en técnicas de tinción y lectura de portaobjetos. Los portaobjetos seleccionados al azar se enviaron a laboratorios de referencia en otros lugares para el control de calidad.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

El ADN de Leishmania donovani en las muestras de sangre recogidas se había detectado utilizando los métodos descritos por Salotra et al.

Recolección de muestras y aislamiento de ADN: La muestra de sangre recolectada se transportó al Laboratorio de Parasitología de ICDDR,B, se transfirió a 4°C y se procesó generalmente el mismo día. El ADN se extrajo de 0,2 ml de sangre utilizando un mini kit de sangre de ADN QIAamp (Qiagen).

Amplificación por PCR: se tomó ADN de parásitos cultivados (1 ng) y de muestras clínicas (100 ng) para amplificación utilizando los cebadores LdI descritos anteriormente. La mezcla de reacción (50 µl) contenía Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, una concentración de 200 µM de cada desoxinucleósido trifosfato, 50 ng de cada cebador y 1,25 U de ADN polimerasa Taq (Gibco BRL ). Cada mezcla de reacción se cubrió con aceite mineral y la amplificación se realizó en un termociclador (Perkin-Elmer, Warrington, Gran Bretaña) programado para 40 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min, hibridación a 45°C durante 1 min. y extensión a 72°C durante 2 min, precedida de una desnaturalización inicial de 2 min a 94°C. La extensión final fue de 3 min a 72°C. Los productos se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% que contenía bromuro de etidio (0,5 µg/ml) en tampón TAE (acetato de Tris 0,04 M, EDTA 0,001 M) y se fotografiaron con iluminación UV.

Mini-exon PCR-RFLP: El mini-exon PCR-RFLP fue desarrollado por el Swiss Tropical Institute (STI) (Marfurth et al. 2003).

Cálculo del tamaño de la muestra y variable(s) de resultado:

El tamaño de la muestra de 200 casos y 100 controles se basa en consideraciones prácticas para cumplir con el objetivo principal de desarrollo de capacidades y el estudio no está formalmente diseñado para probar hipótesis. El énfasis para investigar la sensibilidad y especificidad de las nuevas pruebas de diagnóstico estará en la presentación de estadísticas descriptivas e intervalos de confianza.

Análisis de los datos:

Se calculó la sensibilidad (proporción de resultados positivos verdaderos identificados correctamente) y la especificidad (proporción de resultados negativos verdaderos identificados correctamente) para cada prueba de diagnóstico, y los intervalos de confianza del 95% para estas proporciones se calcularon utilizando el método de Wilson.

Los valores predictivos positivo y negativo también se calcularon utilizando el método descrito por Altman et al. El valor predictivo positivo es la proporción de pacientes con resultado positivo en la prueba diagnóstica experimental que son correctamente diagnosticados por examen parasitológico. De manera similar, el valor predictivo negativo es la proporción de pacientes con un resultado negativo en la prueba diagnóstica que son correctamente diagnosticados por examen parasitológico. Se determinó el IC del 95% para los valores predictivos positivo y negativo. Estos parámetros permitirían la comparación de cada prueba diagnóstica con el examen parasitológico 'estándar de oro'.