En pilotstudie for kapasitetsbygging for et multisenter, randomisert forsøk for behandling av Kala Azar i Bangladesh

Spesifikke mål:

Primært mål: Å utvikle kapasitet til å evaluere nyere regimer for behandling av kala azar i Bangladesh.

Sekundære mål:

1. For å evaluere nye diagnostiske tester for kala azar inkludert rK39 peilepinnetest i serum; KATEX i urin; og PCR (polymerasekjedereaksjon) i blod og kliniske prøver.
2. For å evaluere respons på behandling med 28 injeksjoner av SAG ved bruk av PCR i blodprøver og kliniske prøver.
3. Å overføre mini-exon PCR-RFLP-teknikken til ICDDR,B og å karakterisere de mest utbredte Leishmania-artene i området Mymensingh og deres respons på standardbehandling med SAG.
4. Vi vil også analysere om visse genotyper er assosiert med forekomsten av PKDL og om mini-exon PCR er en egnet markør for å overvåke den intra- og interspecies genetiske utviklingen av Leishmania-arter.

Forskningsdesign og metoder:

Pasientene for den foreslåtte studien ble valgt ut fra tre upazilla-helsekomplekser i Mymensingh per diskusjon med offentlige etater som arbeider i disse områdene. Om nødvendig ville vi gå for aktiv overvåking for å melde på nødvendig antall emner til studien.

Pasienter

Totalt ble 200 påfølgende tilfeller (alder >5 år) som oppfyller følgende diagnostiske kriterier for KA, inkludert i studien: (i) feber i >2 uker; (ii) minst ett av følgende kriterier: splenomegali, mørkfarging av huden og vekttap; og (iii) en positiv rK39 peilepinnetest. Eksklusjonskriterier vil inkludere: (1) barn under fem år, (2) gravide kvinner og (3) pasienter som samtidig lider av enhver annen alvorlig sykdom som ikke er relatert til kala azar. Pasienter (eller deres foreldre/foresatte i tilfelle av mindreårige) som oppfyller kriteriene ovenfor, ble forklart om risikoen ved behandling med SAG og risikoen forbundet med prosedyrer for miltaspirasjon av sakkyndige leger. Informert samtykke (muntlig eller skriftlig) ble deretter innhentet fra pasientene (eller deres foreldre/foresatte i tilfelle mindreårige) før inkludering i studien. Hundre friske individer som bodde i samme område ble registrert som kontroller for å evaluere PCR og andre diagnostiske tester av KA. Våre feltarbeidere besøkte hus i samfunnet og tok blodprøver fra de friske frivillige med deres informerte samtykke.

Studieprosedyrer og vurderinger

Milt aspirasjon:

Miltaspirasjon ble utført hos 200 påfølgende pasienter som hadde blitt presentert med kliniske trekk ved KA med en positiv rK39 peilepinnetest. Milt-aspirasjon ble utført for bekreftelse av diagnose på studiedag 1, og deretter igjen på dag 29 for å vurdere helbredelse fra sykdommen. Således, når et forsøksperson ble funnet å være positivt ved rK39 peilepinnetest, standard pre-prosedyre tester for milt aspirasjon, f.eks. hemoglobin estimering, blødningstid, koaguleringstid og blodplatetall ble utført. Miltaspirasjon ble kun utført hos de som ikke var alvorlig anemiske (Hb ≥ 6 mg/dl), og hadde blodplatetall på >50 000/mikroliter blod. Protrombintiden ble også kontrollert før miltaspirasjon, og de med PT mer enn 4 sekunder forlenget var ikke kvalifisert for studien. All nødvendig behandling ble gitt i tilfelle blødning etter prosedyren, inkludert blodoverføring. Om nødvendig kan pasientene også fraktes til Mymensingh Medical College Hospital, for mer spesialisert behandling og støtte.

Behandling og oppfølging

I Bangladesh er intramuskulær administrering av natriumantimonglukonat (SAG; Albert David Ltd., India), i en dose på 20 mg/kg kroppsvekt, med en maksimal dose på 850 mg/dag, i tjueåtte dager gjeldende standardbehandling for pasienter med KA. Puls og respirasjonsfrekvenser, blodtrykk og temperatur ble overvåket med 12 timers intervaller i løpet av denne behandlingsperioden. EKG ble utført hvis det var klinisk indisert. Behandlingen ble stoppet hvis tegn på alvorlig toksisitet (kardiotoksisitet, nyresvikt osv.) utviklet seg, og pasienten hadde blitt behandlet med standarddose amfotericin B.

Sykehusinnleggelse: Alle pasienter under behandling ble tilbudt å bo på Community-based Medical College Hospital i hele behandlingsperioden med SAG. Pasientene hadde vært innlagt på sykehus for behandling med amfotericin B ved behandlingssvikt eller toksisitet med SAG.

Oppfølging: Ved slutten av behandlingen ble pasientene evaluert for helbredelse ved fysisk undersøkelse og miltaspirasjon. Forsøkspersonene hadde fulgt i seks måneder som vist i skjema-2.

Diagnostiske tester som skal evalueres

rK39 peilepinnetest En blodprøve med fingerstikk ble tatt i kapillærrør for rK39 peilepinnetest. Denne metoden er rask og tidsbesparende.

Parasitologisk diagnose

Miltaspirat ble brukt til parasitologisk diagnose. Et objektglass med miltaspirater ble forberedt for Giemsa-farging. To laboratorieteknikere fra ICDDR,B ble opplært i fargeteknikker og lesing av lysbildene. Tilfeldig utvalgte lysbilder ble sendt til referanselaboratorier andre steder for kvalitetskontroll.

Polymerasekjedereaksjon (PCR)

DNA fra Leishmania donovani i de innsamlede blodprøvene ble påvist ved hjelp av metodene beskrevet av Salotra et al.

Prøvetaking og DNA-isolering: Innsamlet blodprøve ble transportert til Parasitology Laboratory of ICDDR,B, og overført til 4°C og behandlet generelt samme dag. DNA ble ekstrahert fra 0,2 ml blod ved å bruke et QIAamp DNA-blodminisett (Qiagen).

PCR-amplifikasjon: DNA fra dyrkede parasitter (1 ng) og fra kliniske prøver (100 ng) ble tatt for amplifikasjon ved bruk av LdI-primerne beskrevet ovenfor. Reaksjonsblandingen (50 µl) inneholdt 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, en 200 µM konsentrasjon av hvert deoksynukleosidtrifosfat, 50 ng av hver primer og 1,25 U av Taq DNA-polymerase (Gib-DNA-polymerase) ). Hver reaksjonsblanding ble dekket med mineralolje, og amplifikasjon ble utført i en termisk syklus (Perkin-Elmer, Warrington, Storbritannia) programmert for 40 sykluser med denaturering ved 94°C i 1 min, annealing ved 45°C i 1 min. og forlengelse ved 72°C i 2 minutter, etterfulgt av en initial denaturering på 2 minutter ved 94°C. Endelig forlengelse var i 3 minutter ved 72°C. Produktene ble analysert ved elektroforese i 1 % agarosegel inneholdende etidiumbromid (0,5 µg/ml) i TAE-buffer (0,04 M Tris-acetat, 0,001 M EDTA) og fotografert under UV-belysning.

Mini-exon PCR-RFLP: Mini-exon PCR-RFLP var utviklet av Swiss Tropical Institute (STI) (Marfurth et al. 2003).

Eksempelstørrelsesberegning og utfallsvariable(r):

Utvalgsstørrelsen på 200 tilfeller og 100 kontroller er basert på praktiske hensyn for å oppfylle hovedmålet om kapasitetsutvikling, og studien er ikke formelt drevet for hypotesetesting. Vekten for å undersøke sensitivitet og spesifisitet til de nye diagnostiske testene vil være å presentere beskrivende statistikk og konfidensintervaller.

Dataanalyse:

Sensitiviteten (andel av korrekt identifiserte sanne positive resultater) og spesifisitet (andel av korrekt identifiserte sanne negative resultater) ble beregnet for hver diagnostisk test, og 95 % konfidensintervaller for disse proporsjonene ble beregnet ved bruk av Wilsons metode.

De positive og negative prediktive verdiene ble også beregnet ved å bruke metoden beskrevet av Altman et al. Den positive prediktive verdien er andelen pasienter med positivt resultat for den eksperimentelle diagnostiske testen som er korrekt diagnostisert ved parasitologisk undersøkelse. Tilsvarende er den negative prediktive verdien andelen pasienter med et negativt diagnostisk testresultat som er korrekt diagnostisert ved parasitologisk undersøkelse. 95 % KI for de positive og de negative prediktive verdiene var bestemt. Disse parametrene vil tillate sammenligning av hver diagnostisk test med "gullstandarden" parasitologisk undersøkelse.