Une étude pilote pour le renforcement des capacités pour un essai randomisé multicentrique pour le traitement du Kala Azar au Bangladesh

Objectifs spécifiques :

Objectif principal : Développer la capacité d'évaluer de nouveaux schémas thérapeutiques pour le traitement du kala-azar au Bangladesh.

Objectifs secondaires :

1. Évaluer de nouveaux tests de diagnostic pour le kala-azar, y compris le test de bandelette rK39 dans le sérum ; KATEX dans les urines ; et PCR (amplification en chaîne par polymérase) dans le sang et les échantillons cliniques.
2. Évaluer la réponse au traitement avec 28 injections de SAG en utilisant la PCR dans des échantillons de sang et des échantillons cliniques.
3. Transférer la technique PCR-RFLP mini-exon à l'ICDDR,B et caractériser les espèces de Leishmania les plus répandues dans la région de Mymensingh et leur réponse au traitement standard avec SAG.
4. Nous analyserons également si certains génotypes sont associés à la survenue de PKDL et si la PCR mini-exon est un marqueur approprié pour le suivi de l'évolution génétique intra et interspécifique des espèces de Leishmania.

Conception et méthodes de recherche :

Les patients de l'étude proposée ont été sélectionnés dans trois complexes de santé upazilla à Mymensingh après discussion avec les agences gouvernementales travaillant dans ces domaines. Si nécessaire, nous opterions pour une surveillance active afin de recruter le nombre requis de sujets pour l'étude.

Les patients

Au total, 200 cas consécutifs (âge > 5 ans) répondant aux critères diagnostiques suivants pour KA ont été inclus dans l'étude : (i) fièvre pendant > 2 semaines ; (ii) au moins un des critères suivants - splénomégalie, assombrissement de la peau et perte de poids ; et (iii) une bandelette réactive rK39 positive. Les critères d'exclusion incluront : (1) les enfants de moins de cinq ans, (2) les femmes enceintes et (3) les patients qui souffrent simultanément de toute autre maladie grave non liée au kala-azar. Les patients (ou leurs parents/tuteurs en cas de mineurs) répondant aux critères ci-dessus, ont été expliqués sur le risque du traitement par SAG et le risque lié aux procédures d'aspiration splénique par des médecins experts. Un consentement éclairé (verbal ou écrit) a ensuite été obtenu des patients (ou de leurs parents/tuteurs en cas de mineurs) avant inclusion dans l'étude. Une centaine d'individus en bonne santé vivant dans la même zone ont été recrutés comme témoins pour évaluer la PCR et d'autres tests de diagnostic de KA. Nos agents de terrain se sont rendus dans les maisons de la communauté et ont prélevé des échantillons de sang sur les volontaires sains avec leur consentement éclairé.

Procédures d'étude et évaluations

Aspiration splénique :

L'aspiration splénique a été réalisée chez 200 patients consécutifs qui avaient été présentés avec des caractéristiques cliniques de KA avec une bandelette réactive rK39 positive. Une aspiration splénique a été réalisée pour confirmer le diagnostic le jour 1 de l'étude, puis à nouveau le jour 29 pour évaluer la guérison de la maladie. Ainsi, lorsqu'un sujet s'est avéré positif par le test de la bandelette réactive rK39, les tests standard de pré-procédure pour l'aspiration splénique, par ex. l'estimation de l'hémoglobine, le temps de saignement, le temps de coagulation et la numération plaquettaire ont été effectués. L'aspiration splénique n'a été pratiquée que chez ceux qui n'étaient pas sévèrement anémiques (Hb ≥ 6 mg/dl) et avaient une numération plaquettaire > 50 000/microlitre de sang. Le temps de prothrombine a également été vérifié avant l'aspiration splénique et ceux avec un TP prolongé de plus de 4 secondes n'étaient pas éligibles pour l'étude. Tous les traitements nécessaires ont été prodigués en cas d'hémorragie consécutive à l'intervention, y compris la transfusion sanguine. Si nécessaire, les patients seront également transportés au Mymensingh Medical College Hospital, pour un traitement et un soutien plus spécialisés.

Traitement et suivi

Au Bangladesh, l'administration intramusculaire de gluconate de sodium et d'antimoine (SAG ; Albert David Ltd., Inde), à ​​une dose de 20 mg/kg de poids corporel, avec une dose maximale de 850 mg/jour, pendant vingt-huit jours est le traitement standard actuel pour les patients atteints de KA. Le pouls et les fréquences respiratoires, les pressions sanguines et la température ont été surveillés à des intervalles de 12 heures pendant cette période de traitement. Des électrocardiogrammes ont été réalisés si cliniquement indiqués. Le traitement était arrêté si des signes de toxicité sévère (cardiotoxicité, insuffisance rénale, etc.) se développaient, et le patient avait été traité avec une dose standard d'amphotéricine B.

Hospitalisation : tous les patients sous traitement se sont vu proposer de rester au Community-based Medical College Hospital pendant toute la durée du traitement par SAG. Les patients avaient été hospitalisés pour un traitement par amphotéricine B en cas d'échec du traitement ou de toxicité au SAG.

Suivi : à la fin du traitement, les patients ont été évalués pour la guérison par un examen physique et une aspiration splénique. Les sujets suivaient depuis six mois, comme indiqué dans le Schéma-2.

Tests diagnostiques à évaluer

Test de la bandelette réactive rK39 Un échantillon de sang par piqûre au doigt a été prélevé dans des tubes capillaires pour le test de la bandelette réactive rK39. Cette méthode est rapide et fait gagner du temps.

Diagnostic parasitologique

L'aspiration splénique a été utilisée pour le diagnostic parasitologique. Une lame d'aspirations spléniques a été préparée pour la coloration de Giemsa. Deux techniciens de laboratoire de l'ICDDR,B ont été formés aux techniques de coloration et à la lecture des lames. Des lames sélectionnées au hasard avaient été envoyées à des laboratoires de référence ailleurs pour le contrôle de la qualité.

Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

L'ADN de Leishmania donovani dans les échantillons de sang prélevés avait été détecté en utilisant les méthodes décrites par Salotra et al.

Collecte d'échantillons et isolement de l'ADN : les échantillons de sang collectés ont été transportés au laboratoire de parasitologie de l'ICDDR, B, et transférés à 4 °C et traités généralement le même jour. L'ADN a été extrait de 0,2 ml de sang à l'aide d'un mini kit de sang QIAamp DNA (Qiagen).

Amplification par PCR : de l'ADN de parasites cultivés (1 ng) et d'échantillons cliniques (100 ng) ont été prélevés pour amplification à l'aide des amorces LdI décrites ci-dessus. Le mélange réactionnel (50 µl) contenait du Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), du KCl 50 mM, du MgCl2 1,5 mM, une concentration de 200 µM de chaque désoxynucléoside triphosphate, 50 ng de chaque amorce et 1,25 U d'ADN polymérase Taq (Gibco BRL ). Chaque mélange réactionnel a été recouvert d'huile minérale et l'amplification a été réalisée dans un thermocycleur (Perkin-Elmer, Warrington, Grande-Bretagne) programmé pour 40 cycles de dénaturation à 94°C pendant 1 min, recuit à 45°C pendant 1 min, et extension à 72°C pendant 2 min, précédée d'une dénaturation initiale de 2 min à 94°C. L'extension finale était de 3 min à 72°C. Les produits ont été analysés par électrophorèse dans un gel d'agarose à 1 % contenant du bromure d'éthidium (0,5 ug/ml) dans un tampon TAE (acétate de Tris 0,04 M, EDTA 0,001 M) et photographiés sous éclairage UV.

Mini-exon PCR-RFLP : Le mini-exon PCR-RFLP a été développé par l'Institut Tropical Suisse (IST) (Marfurth et al. 2003).

Calcul de la taille de l'échantillon et variable(s) de résultat :

La taille de l'échantillon de 200 cas et 100 témoins est basée sur des considérations pratiques pour atteindre l'objectif principal de développement des capacités et l'étude n'est pas formellement alimentée pour tester des hypothèses. Pour étudier la sensibilité et la spécificité des nouveaux tests diagnostiques, l'accent sera mis sur la présentation de statistiques descriptives et d'intervalles de confiance.

L'analyse des données:

La sensibilité (proportion de vrais positifs correctement identifiés) et la spécificité (proportion de vrais négatifs correctement identifiés) ont été calculées pour chaque test de diagnostic, et des intervalles de confiance à 95 % pour ces proportions ont été calculés à l'aide de la méthode de Wilson.

Les valeurs prédictives positives et négatives ont également été calculées selon la méthode décrite par Altman et al. La valeur prédictive positive est la proportion de patients ayant un résultat positif au test diagnostique expérimental et correctement diagnostiqués par examen parasitologique. De même, la valeur prédictive négative est la proportion de patients avec un résultat de test diagnostique négatif qui sont correctement diagnostiqués par examen parasitologique. L'IC à 95 % pour les valeurs prédictives positives et négatives avait été déterminé. Ces paramètres permettraient de comparer chaque test diagnostique avec l'examen parasitologique « gold standard ».