Kísérleti tanulmány kapacitásépítésről egy többközpontú, randomizált kísérletben a Kala Azar kezelésére Bangladesben

Konkrét célok:

Elsődleges cél: Kapacitás fejlesztése a kala azar kezelésére szolgáló újabb sémák értékelésére Bangladesben.

Másodlagos célok:

1. A kala azar új diagnosztikai tesztjeinek értékelése, beleértve az rK39 mérőpálca tesztet szérumban; KATEX a vizeletben; és PCR (polimeráz láncreakció) vérben és klinikai mintákban.
2. A 28 SAG injekcióval végzett kezelésre adott válasz értékelése PCR segítségével vérmintákban és klinikai mintákban.
3. A mini-exon PCR-RFLP technika átvitele az ICDDR,B-be, és jellemezni a Mymensingh területén legelterjedtebb Leishmania fajokat és válaszukat a standard SAG-kezelésre.
4. Azt is megvizsgáljuk, hogy bizonyos genotípusok összefüggésben állnak-e a PKDL előfordulásával, és hogy a mini-exon PCR megfelelő marker-e a Leishmania fajok intra- és fajok közötti genetikai evolúciójának nyomon követésére.

Kutatási tervezés és módszerek:

A javasolt vizsgálatban részt vevő betegeket három mymensinghi upazilla egészségügyi komplexumból választották ki, az ezeken a területeken dolgozó kormányzati szervekkel folytatott megbeszélések alapján. Ha szükséges, aktív megfigyelésre mennénk, hogy a szükséges számú alanyt bevonjuk a vizsgálatba.

Betegek

Összesen 200 egymást követő esetet (5 év feletti életkor), amelyek megfeleltek a KA következő diagnosztikai kritériumainak, vontak be a vizsgálatba: (i) 2 hétnél hosszabb láz; (ii) a következő kritériumok legalább egyike – lépmegnagyobbodás, a bőr sötétedése és súlycsökkenés; és (iii) pozitív rK39 nívópálca-teszt. A kizárási kritériumok közé tartoznak a következők: (1) öt év alatti gyermekek, (2) terhes nők és (3) olyan betegek, akik egyidejűleg bármilyen más súlyos betegségben szenvednek, amely nem kapcsolódik a kala azarhoz. A fenti kritériumoknak megfelelő betegeket (vagy kiskorúak esetén szüleiket/gondviselőiket) szakértő orvosok ismertették az SAG-kezelés és a lépaspirációs eljárások kockázatával kapcsolatban. Ezt követően a betegektől (vagy kiskorúak esetén szüleiktől/gondviselőiktől) tájékozott beleegyezést kaptak (szóban vagy írásban), mielőtt bevonták őket a vizsgálatba. Száz, ugyanazon a területen élő egészséges egyént vontak be kontrollként a KA PCR és egyéb diagnosztikai tesztjeinek értékelésére. Területi dolgozóink a közösség házait látogatták meg, és az egészséges önkéntesektől vérmintát vettek, beleegyezésével.

Tanulmányi eljárások és értékelések

Lépszívás:

Lépaspirációt végeztek 200 egymást követő betegnél, akiknél a KA klinikai tüneteit mutatták be pozitív rK39 mérőpálca-teszttel. Lépszívást végeztünk a diagnózis megerősítésére a vizsgálat 1. napján, majd a 29. napon ismét a betegségből való gyógyulás értékelésére. Így, ha az alany az rK39 mérőpálca-teszttel pozitívnak bizonyult, szabványos eljárás előtti lépszívási teszteket, pl. hemoglobinbecslést, vérzési időt, véralvadási időt és vérlemezkeszámot végeztünk. Lépszívást csak azoknál végeztek, akik nem voltak súlyosan anémiások (Hb ≥ 6 mg/dl), és a vérlemezkeszámuk >50 000/mikroliter vér volt. A protrombin időt a lépszívás előtt is ellenőrizték, és azok, akiknél a PT több mint 4 másodpercig megnyúlt, nem voltak alkalmasak a vizsgálatra. Az eljárást követő vérzés esetére minden szükséges kezelést biztosítottak, beleértve a vérátömlesztést is. Szükség esetén a betegeket a Mymensingh Medical College kórházba is szállítják speciálisabb kezelés és támogatás céljából.

Kezelés és nyomon követés

Bangladesben a nátrium-antimon-glükonát (SAG; Albert David Ltd., India) intramuszkuláris beadása 20 mg/ttkg dózisban, maximum 850 mg/nap dózisban, huszonnyolc napon keresztül a jelenlegi standard kezelés. KA betegek számára. A pulzus- és légzésszámot, a vérnyomást és a hőmérsékletet 12 órás időközönként monitoroztuk ebben a kezelési időszakban. EKG-t végeztek, ha klinikailag indokolt. A kezelést leállították, ha súlyos toxicitás jelei (kardiotoxicitás, veseelégtelenség stb.) jelentkeztek, és a beteget standard dózisú amfotericin B-vel kezelték.

Kórházi ellátás: Minden kezelés alatt álló betegnek felajánlották, hogy a közösségi alapú Medical College Hospitalban maradjon a SAG-kezelés teljes időtartama alatt. A betegek amfotericin B-kezelésre kórházba kerültek a kezelés sikertelensége vagy SAG-toxicitása miatt.

Nyomon követés: A kezelés végén fizikális vizsgálattal és lépszívással értékelték a betegek gyógyulását. Az alanyok hat hónapig követték nyomon, amint azt a 2. séma mutatja.

Értékelendő diagnosztikai vizsgálatok

rK39 mérőpálca-teszt Az rK39 mérőpálca-teszthez kapilláriscsövekben ujjbegyből szúrt vérmintát vettünk. Ez a módszer gyors és időtakarékos.

Parazitológiai diagnózis

A parazitológiai diagnózishoz lépaspirátot használtunk. A lép-aspirátum tárgylemezét készítettük elő a Giemsa-festéshez. Az ICDDR,B két labortechnikusát képezték ki a festési technikákról és a tárgylemezek leolvasásáról. A véletlenszerűen kiválasztott tárgylemezeket minőség-ellenőrzés céljából más referencialaboratóriumokba küldték.

Polimeráz láncreakció (PCR)

Az összegyűjtött vérmintákban a Leishmania donovani DNS-ét Salotra és munkatársai által leírt módszerekkel mutatták ki.

Mintagyűjtés és DNS izolálás: Az összegyűjtött vérmintát az ICDDR,B Parazitológiai Laboratóriumába szállították, és 4 °C-ra vitték át, és általában ugyanazon a napon dolgozták fel. A DNS-t 0,2 ml vérből extraháltuk QIAamp DNS vér mini kit (Qiagen) segítségével.

PCR amplifikáció: tenyésztett parazitákból (1 ng) és klinikai mintákból (100 ng) DNS-t vettünk az amplifikációhoz a fent leírt LdI primerekkel. A reakcióelegy (50 µl) 10 mM Tris-HCl-t (pH 8,3), 50 mM KCl-t, 1,5 mM MgCl2-t, 200 µM-os dezoxinukleozid-trifoszfátot, 50 ng primert és 1,25 U Taqb DNAcoRL-t tartalmazott. ). Mindegyik reakcióelegyet bevontuk ásványolajjal, és az amplifikációt egy termikus ciklusos berendezésben (Perkin-Elmer, Warrington, Nagy-Britannia) végeztük, amely 40 denaturálási ciklusra volt programozva 94 °C-on 1 percig, majd 45 °C-on 1 percig lágyítva. és 72 °C-on 2 percig meghosszabbítjuk, amelyet 2 perces kezdeti denaturáció előz meg 94 °C-on. A végső meghosszabbítás 3 percig volt 72 °C-on. A termékeket elektroforézissel elemeztük 1%-os agaróz gélben, amely etidium-bromidot (0,5 µg/ml) tartalmazott TAE pufferben (0,04 M Tris-acetát, 0,001 M EDTA), és UV megvilágítás mellett fényképeztük.

Mini-exon PCR-RFLP: A mini-exon PCR-RFLP-t a Swiss Tropical Institute (STI) fejlesztette ki (Marfurth et al. 2003).

A mintaméret számítása és az eredményváltozó(k):

A 200 esetből és 100 kontrollból álló mintanagyság gyakorlati megfontolásokon alapul a kapacitásfejlesztés elsődleges célkitűzésének teljesítése érdekében, és a tanulmány formálisan nem alkalmas hipotézisek tesztelésére. Az új diagnosztikai tesztek szenzitivitásának és specificitásának vizsgálata során a hangsúly a leíró statisztikák és konfidenciaintervallumok bemutatásán lesz.

Adatelemzés:

A szenzitivitást (a helyesen azonosított valódi pozitív eredmények arányát) és a specificitást (a helyesen azonosított valódi negatív eredmények arányát) minden diagnosztikai teszthez kiszámítottuk, és ezekre az arányokra 95%-os konfidencia intervallumot számítottunk ki Wilsons módszerrel.

A pozitív és negatív prediktív értékeket is az Altman és munkatársai által leírt módszerrel számítottuk ki. A pozitív prediktív érték azon betegek aránya, akiknél a kísérleti diagnosztikai teszt pozitív eredményt ad, és akiknél a parazitológiai vizsgálat helyesen diagnosztizált. Hasonlóképpen a negatív prediktív érték a negatív diagnosztikai teszteredménnyel rendelkező betegek aránya, akiknél a parazitológiai vizsgálat helyesen diagnosztizált. Meghatároztuk a pozitív és a negatív prediktív értékek 95%-os CI-jét. Ezek a paraméterek lehetővé teszik az egyes diagnosztikai tesztek összehasonlítását a „gold standard” parazitológiai vizsgálattal.