방글라데시에서 Kala Azar 치료를 위한 다기관 무작위 임상시험의 역량 강화를 위한 파일럿 연구

구체적인 목표:

1차 목표: 방글라데시에서 칼라 아자르 치료를 위한 새로운 요법을 평가할 수 있는 능력을 개발합니다.

보조 목표:

1. 혈청 내 rK39 딥스틱 테스트를 포함하여 칼라 아자르에 대한 새로운 진단 테스트를 평가하기 위해; 소변 내 KATEX; 및 혈액 및 임상 샘플에서 PCR(중합 효소 연쇄 반응).
2. 혈액 샘플 및 임상 샘플에서 PCR을 사용하여 SAG를 28회 주사하여 치료에 대한 반응을 평가합니다.
3. 미니 엑손 PCR-RFLP 기술을 ICDDR,B로 이전하고 Mymensingh 지역에서 가장 널리 퍼진 Leishmania 종과 SAG를 사용한 표준 치료에 대한 반응을 특성화합니다.
4. 우리는 또한 특정 유전자형이 PKDL의 발생과 연관되어 있는지 여부와 미니 엑손 PCR이 Leishmania 종의 종내 및 종간 유전적 진화를 모니터링하는 데 적합한 마커인지 여부를 분석할 것입니다.

연구 설계 및 방법:

제안된 연구를 위한 환자는 이 분야에서 일하는 정부 기관과의 논의를 통해 Mymensingh에 있는 3개의 upazilla 건강 단지에서 선택되었습니다. 필요한 경우 능동 감시를 통해 연구에 필요한 피험자 수를 등록합니다.

환자

KA에 대한 다음 진단 기준을 충족하는 총 200개의 연속 사례(연령 >5세)가 연구에 등록되었습니다: (i) >2주 동안 발열; (ii) 다음 기준 중 적어도 하나 - 비장 비대, 피부 흑화 및 체중 감소; 및 (iii) 양성 rK39 딥스틱 테스트. 제외 기준은 다음을 포함합니다: (1) 5세 미만의 어린이, (2) 임산부 및 (3) kala azar와 관련이 없는 다른 심각한 질병을 동시에 앓고 있는 환자. 위의 기준을 충족하는 환자(또는 미성년자의 경우 부모/보호자)는 SAG 치료의 위험 및 비장 흡인 절차와 관련된 위험에 대해 전문의의 설명을 받았습니다. 그런 다음 연구에 포함되기 전에 환자(또는 미성년자의 경우 부모/보호자)로부터 정보에 입각한 동의(구두 또는 서면)를 얻었습니다. 같은 지역에 거주하는 100명의 건강한 개인이 PCR 및 기타 KA 진단 테스트를 평가하기 위한 대조군으로 등록되었습니다. 우리 현장 작업자들은 지역 사회의 집을 방문하고 정보에 입각한 동의하에 건강한 자원 봉사자들로부터 혈액 샘플을 수집했습니다.

연구 절차 및 평가

비장 흡인:

비장 흡인은 양성 rK39 딥스틱 테스트에서 KA의 임상적 특징을 제시한 200명의 연속 환자에서 수행되었습니다. 연구 1일에 진단을 확인하기 위해 비장 흡인을 수행한 다음 질병의 치료를 평가하기 위해 29일에 다시 수행했습니다. 따라서, 피험자가 rK39 딥스틱 검사에서 양성으로 판명되면, 비장 흡인에 대한 표준 사전 절차 검사, 예를 들어. 헤모글로빈 추정, 출혈시간, 응고시간, 혈소판수를 측정하였다. 비장 흡인은 심각한 빈혈(Hb ≥ 6 mg/dl)이 아니고 혈소판 수가 >50,000/마이크로리터인 사람들에게만 시행되었습니다. 프로트롬빈 시간도 비장 흡인 전에 확인하였고 PT가 4초 이상 연장된 경우 연구 대상에서 제외하였다. 수혈을 포함하여 절차 후 출혈의 경우 필요한 모든 치료가 제공되었습니다. 필요한 경우 환자는 보다 전문적인 치료와 지원을 위해 Mymensingh Medical College Hospital로 이송됩니다.

치료 및 후속 조치

방글라데시에서는 글루콘산안티몬나트륨(SAG; Albert David Ltd., India)을 20일 동안 체중 1kg당 20mg, 최대 850mg을 28일 동안 근육내 투여하는 것이 현재 표준 치료입니다. KA 환자의 경우. 이 치료 기간 동안 맥박수, 호흡수, 혈압 및 체온을 12시간 간격으로 모니터링했습니다. EKG는 임상적으로 필요한 경우 수행되었습니다. 심각한 독성 징후(심장 독성, 신부전 등)가 발생하면 치료를 중단하고 환자는 표준 용량의 amphotericin B로 치료를 받았습니다.

입원: 치료 중인 모든 환자는 SAG로 전체 치료 기간 동안 커뮤니티 기반 의과 대학 병원에 머물도록 제안되었습니다. 환자들은 치료 실패 또는 SAG 독성의 경우 amphotericin B 치료를 위해 입원했습니다.

후속 조치: 치료가 끝날 때 환자는 신체 검사와 비장 흡인을 통해 완치 여부를 평가했습니다. 피험자들은 Scheme-2와 같이 6개월 동안 따라다녔다.

평가할 진단 테스트

rK39 딥스틱 테스트 rK39 딥스틱 테스트를 위해 손가락으로 채혈한 혈액 표본을 모세관에 수집했습니다. 이 방법은 신속하고 시간을 절약합니다.

기생충 진단

비장 흡인은 기생충 진단에 사용되었습니다. Giemsa 염색을 위해 비장 흡인물 슬라이드를 준비했습니다. ICDDR,B의 실험실 기술자 두 명은 염색 기술과 슬라이드 읽기에 대한 교육을 받았습니다. 무작위로 선택된 슬라이드는 품질 관리를 위해 다른 곳의 참조 실험실로 보내졌습니다.

중합효소 연쇄반응(PCR)

수집된 혈액 샘플에서 Leishmania donovani의 DNA는 Salotra et al.

검체 채취 및 DNA 분리: 채취한 혈액 검체는 ICDDR,B의 기생충학 실험실로 이송하여 4°C로 옮겨 일반적으로 당일 처리하였다. QIAamp DNA 혈액 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 0.2ml의 혈액에서 DNA를 추출했습니다.

PCR 증폭: 위에서 설명한 LdI 프라이머를 사용하여 증폭을 위해 배양된 기생충(1ng) 및 임상 샘플(100ng)의 DNA를 채취했습니다. 반응 혼합물(50μl)은 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 200μM 농도의 각 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트, 각 프라이머 50ng, Taq DNA 폴리머라제 1.25U(Gibco BRL ). 각 반응 혼합물을 미네랄 오일로 덧씌우고, 94°C에서 1분 동안 변성, 45°C에서 1분 동안 어닐링, 및 94°C에서 2분의 초기 변성이 뒤따르는 72°C에서 2분 동안 연장. 최종 확장은 72°C에서 3분 동안 수행되었습니다. 제품은 TAE 버퍼(0.04M Tris acetate, 0.001M EDTA)에 ethidium bromide(0.5µg/ml)가 함유된 1% 아가로스 젤에서 전기영동으로 분석하고 UV 조명 하에서 사진을 찍었습니다.

미니 엑손 PCR-RFLP: 미니 엑손 PCR-RFLP는 스위스 열대 연구소(STI)에서 개발했습니다(Marfurth et al. 2003).

샘플 크기 계산 및 결과 변수:

200개 사례와 100개 대조군의 표본 크기는 능력 개발의 주요 목표를 충족하기 위한 실제적인 고려 사항을 기반으로 하며 연구는 공식적으로 가설 테스트를 위해 제공되지 않습니다. 새로운 진단 테스트의 민감도와 특이도를 조사하기 위한 강조점은 기술 통계 및 신뢰 구간을 제시하는 것입니다.

데이터 분석:

각 진단 테스트에 대해 민감도(정확하게 식별된 참 양성 결과의 비율) 및 특이성(정확하게 식별된 참 음성 결과의 비율)을 계산했으며 이러한 비율에 대한 95% 신뢰 구간은 Wilsons 방법을 사용하여 계산되었습니다.

양성 및 음성 예측값도 Altman et al.에 의해 기술된 방법을 사용하여 계산되었습니다. 양성예측도는 실험진단검사에서 양성으로 나온 환자 중 기생충학적 검사에서 정확하게 진단된 환자의 비율이다. 유사하게 음의 예측도는 기생충학적 검사에 의해 정확하게 진단된 음성 진단 테스트 결과를 가진 환자의 비율입니다. 양성 및 음성 예측값에 대한 95% CI가 결정되었습니다. 이러한 매개변수를 통해 각 진단 테스트를 '골드 표준' 기생충 검사와 비교할 수 있습니다.