Pilotní studie pro budování kapacit pro multicentrický, randomizovaný pokus pro léčbu Kala Azar v Bangladéši

Konkrétní cíle:

Primární cíl: Vyvinout kapacitu pro hodnocení novějších režimů pro léčbu kala azar v Bangladéši.

Sekundární cíle:

1. Vyhodnotit nové diagnostické testy na kala azar včetně testu rK39 dipstickem v séru; KATEX v moči; a PCR (polymerázová řetězová reakce) v krvi a klinických vzorcích.
2. Vyhodnotit odpověď na léčbu 28 injekcemi SAG pomocí PCR ve vzorcích krve a klinických vzorcích.
3. Přenést techniku ​​mini-exon PCR-RFLP do ICDDR,B a charakterizovat nejrozšířenější druhy Leishmania v oblasti Mymensingh a jejich odpověď na standardní léčbu SAG.
4. Budeme také analyzovat, zda určité genotypy souvisí s výskytem PKDL a zda je miniexonová PCR vhodným markerem pro sledování vnitrodruhové a mezidruhové genetické evoluce druhů Leishmania.

Design a metody výzkumu:

Pacienti pro navrhovanou studii byli vybráni ze tří zdravotních komplexů upazilla v Mymensinghu na základě diskuse s vládními agenturami pracujícími v těchto oblastech. V případě potřeby bychom šli na aktivní dohled, abychom zapsali požadovaný počet subjektů do studie.

Pacienti

Celkem bylo do studie zařazeno 200 po sobě jdoucích případů (věk >5 let) splňujících následující diagnostická kritéria pro KA: (i) horečka po dobu >2 týdnů; (ii) alespoň jedno z následujících kritérií – splenomegalie, ztmavnutí kůže a ztráta hmotnosti; a (iii) pozitivní test měrkou rK39. Kritéria vyloučení budou zahrnovat: (1) děti mladší pěti let, (2) těhotné ženy a (3) pacienty, kteří současně trpí jakýmkoli jiným závažným onemocněním, které nesouvisí s kala azar. Pacientům (nebo jejich rodičům/opatrovníkům v případě nezletilých dětí), kteří splňují výše uvedená kritéria, byli odborní lékaři vysvětleni o riziku léčby SAG a riziku spojeném s procedurami aspirace sleziny. Informovaný souhlas (ústní nebo písemný) byl poté získán od pacientů (nebo jejich rodičů/opatrovníků v případě nezletilých) před zařazením do studie. Sto zdravých jedinců žijících ve stejné oblasti bylo zařazeno jako kontrola pro hodnocení PCR a dalších diagnostických testů KA. Naši terénní pracovníci navštěvovali domy v komunitě a odebírali vzorky krve od zdravých dobrovolníků s jejich informovaným souhlasem.

Studijní postupy a hodnocení

Slezinná aspirace:

Aspirace sleziny byla provedena u 200 po sobě jdoucích pacientů, u kterých byly prezentovány klinické příznaky KA s pozitivním testem rK39 dipstickem. Pro potvrzení diagnózy byla provedena aspirace sleziny 1. den studie a poté znovu 29. den pro posouzení vyléčení nemoci. Když se tedy zjistilo, že subjekt je pozitivní testem rK39 měrkou, standardní předprocedurální testy pro aspiraci sleziny, např. Byl proveden odhad hemoglobinu, doba krvácení, doba srážení a počet krevních destiček. Aspirace sleziny byla provedena pouze u těch, kteří nebyli závažně anemičtí (Hb ≥ 6 mg/dl) a měli počet krevních destiček > 50 000/mikrolitr krve. Protrombinový čas byl také zkontrolován před aspirací sleziny a ti, kteří měli PT delší než 4 sekundy, nebyli způsobilí pro studii. V případě krvácení po zákroku byla poskytnuta veškerá nezbytná léčba, včetně krevní transfuze. V případě potřeby budou pacienti také převezeni do nemocnice Mymensingh Medical College Hospital pro specializovanější léčbu a podporu.

Léčba a sledování

V Bangladéši je současnou standardní léčbou intramuskulární podávání glukonátu sodného antimonitého (SAG; Albert David Ltd., Indie) v dávce 20 mg/kg tělesné hmotnosti s maximální dávkou 850 mg/den po dobu dvaceti osmi dnů. pro pacienty s KA. Během tohoto léčebného období byly ve 12 hodinových intervalech monitorovány puls a frekvence dýchání, krevní tlak a teplota. Pokud je to klinicky indikováno, bylo provedeno EKG. Léčba byla zastavena, pokud se objevily známky závažné toxicity (kardiotoxicita, selhání ledvin atd.), a pacient byl léčen standardní dávkou amfotericinu B.

Hospitalizace: Všem léčeným pacientům bylo nabídnuto, aby zůstali v Community-based Medical College Hospital po celou dobu léčby SAG. Pacienti byli hospitalizováni pro léčbu amfotericinem B v případě selhání léčby nebo toxicity SAG.

Sledování: Na konci léčby bylo u pacientů hodnoceno vyléčení fyzikálním vyšetřením a aspirací sleziny. Subjekty sledovaly šest měsíců, jak ukazuje schéma-2.

Diagnostické testy k vyhodnocení

rK39 test dipstick Vzorek krve z prstu byl odebrán do kapilárních zkumavek pro rK39 test dipstick. Tato metoda je rychlá a časově nenáročná.

Parazitologická diagnostika

Pro parazitologickou diagnostiku byl použit slezinný aspirát. Pro barvení podle Giemsy bylo připraveno sklíčko aspirátů sleziny. Dva laboratorní technici z ICDDR,B byli vyškoleni v technikách barvení a čtení preparátů. Náhodně vybrané preparáty byly odeslány do referenčních laboratoří jinde pro kontrolu kvality.

Polymerázová řetězová reakce (PCR)

DNA Leishmania donovani v odebraných vzorcích krve byla detekována pomocí metod popsaných Salotrou et al.

Odběr vzorků a izolace DNA: Odebraný krevní vzorek byl transportován do parazitologické laboratoře ICDDR,B a přenesen do 4°C a zpracován zpravidla ve stejný den. DNA byla extrahována z 0,2 ml krve pomocí mini soupravy QIAamp DNA blood (Qiagen).

PCR amplifikace: DNA z kultivovaných parazitů (1 ng) az klinických vzorků (100 ng) byly odebrány pro amplifikaci pomocí LdI primerů popsaných výše. Reakční směs (50 ul) obsahovala 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 200 uM koncentraci každého deoxynukleosidtrifosfátu, 50 ng každého primeru a 1,25 U Taq DNA BRL polymerázy (Gib ). Každá reakční směs byla překryta minerálním olejem a amplifikace byla provedena v tepelném cyklovači (Perkin-Elmer, Warrington, Velká Británie) naprogramovaném na 40 cyklů denaturace při 94 °C po dobu 1 minuty, žíhání při 45 °C po dobu 1 minuty, a extenze při 72 °C po dobu 2 minut, čemuž předcházela počáteční denaturace 2 minuty při 94 °C. Finální extenze byla 3 minuty při 72 °C. Produkty byly analyzovány elektroforézou v 1% agarózovém gelu obsahujícím ethidium bromid (0,5 ug/ml) v TAE pufru (0,04 M Tris acetát, 0,001 M EDTA) a fotografovány pod UV osvětlením.

Mini-exon PCR-RFLP: Mini-exon PCR-RFLP byl vyvinut Švýcarským tropickým institutem (STI) (Marfurth et al. 2003).

Výpočet velikosti vzorku a proměnné(y) výsledku:

Velikost vzorku 200 případů a 100 kontrol je založena na praktických úvahách pro splnění primárního cíle rozvoje kapacit a studie není formálně určena pro testování hypotéz. Důraz při zkoumání citlivosti a specifičnosti nových diagnostických testů bude kladen na prezentaci deskriptivní statistiky a intervalů spolehlivosti.

Analýza dat:

Senzitivita (podíl správně identifikovaných skutečně pozitivních výsledků) a specificita (podíl správně identifikovaných skutečně negativních výsledků) byly vypočteny pro každý diagnostický test a 95% intervaly spolehlivosti pro tyto podíly byly vypočteny pomocí Wilsonsovy metody.

Pozitivní a negativní prediktivní hodnoty byly také vypočteny pomocí metody popsané v Altman et al. Pozitivní prediktivní hodnota je podíl pacientů s pozitivním výsledkem pro experimentální diagnostický test, kteří jsou správně diagnostikováni parazitologickým vyšetřením. Podobně negativní prediktivní hodnota je podíl pacientů s negativním výsledkem diagnostického testu, kteří jsou správně diagnostikováni parazitologickým vyšetřením. Byl stanoven 95% CI pro pozitivní a negativní prediktivní hodnoty. Tyto parametry by umožnily srovnání každého diagnostického testu s parazitologickým vyšetřením „zlatého standardu“.