Een pilootstudie voor capaciteitsopbouw voor een multicentrische, gerandomiseerde studie voor de behandeling van Kala Azar in Bangladesh

Specifieke doelstellingen:

Primaire doelstelling: capaciteit ontwikkelen om nieuwere regimes voor de behandeling van kala azar in Bangladesh te evalueren.

Secundaire doelstellingen:

1. Evaluatie van nieuwe diagnostische tests voor kala azar, waaronder rK39-peilstoktest in serum; KATEX in de urine; en PCR (polymerasekettingreactie) in bloed en klinische monsters.
2. Om de respons op de behandeling te evalueren met 28 injecties SAG met behulp van PCR in bloedmonsters en klinische monsters.
3. Om de mini-exon PCR-RFLP-techniek over te brengen naar ICDDR,B en om de meest voorkomende Leishmania-soorten in het gebied van Mymensingh en hun respons op standaardbehandeling met SAG te karakteriseren.
4. We zullen ook analyseren of bepaalde genotypen geassocieerd zijn met het optreden van PKDL en of de mini-exon PCR een geschikte marker is om de intra- en interspecies genetische evolutie van Leishmania-soorten op te volgen.

Onderzoeksontwerp en methoden:

De patiënten voor de voorgestelde studie werden geselecteerd uit drie upazilla-gezondheidscomplexen in Mymensingh na overleg met de overheidsinstanties die in deze gebieden werken. Indien nodig zouden we voor actieve bewaking gaan om het vereiste aantal proefpersonen voor het onderzoek in te schrijven.

Patiënten

In totaal werden 200 opeenvolgende gevallen (leeftijd >5 jaar) die aan de volgende diagnostische criteria voor KA voldeden, opgenomen in het onderzoek: (i) koorts gedurende >2 weken; (ii) ten minste een van de volgende criteria: splenomegalie, donker worden van de huid en gewichtsverlies; en (iii) een positieve rK39 peilstoktest. Uitsluitingscriteria zijn onder meer: ​​(1) kinderen jonger dan vijf jaar, (2) zwangere vrouwen en (3) patiënten die gelijktijdig lijden aan een andere ernstige ziekte die geen verband houdt met kala azar. Patiënten (of hun ouders/verzorgers in het geval van minderjarigen) die aan de bovenstaande criteria voldeden, kregen uitleg over het risico van behandeling met SAG en het risico van miltafzuiging door deskundige artsen. Geïnformeerde toestemming (mondeling of schriftelijk) werd vervolgens verkregen van de patiënten (of hun ouders/voogden in het geval van minderjarigen) voordat ze in het onderzoek werden opgenomen. Honderd gezonde individuen die in hetzelfde gebied woonden, werden ingeschreven als controles voor het evalueren van PCR en andere diagnostische tests van KA. Onze veldwerkers bezochten huizen in de gemeenschap en namen met hun geïnformeerde toestemming bloedmonsters af bij de gezonde vrijwilligers.

Studieprocedures en beoordelingen

Milt aspiratie:

Milt aspiratie werd uitgevoerd bij 200 opeenvolgende patiënten die klinische kenmerken van KA hadden gekregen met een positieve rK39 dipstick-test. Milt aspiratie werd uitgevoerd voor bevestiging van de diagnose op studiedag 1, en vervolgens opnieuw op dag 29 om genezing van de ziekte te beoordelen. Dus wanneer een proefpersoon positief bleek te zijn door rK39 dipstick-test, standaard pre-procedure tests voor milt aspiratie b.v. hemoglobineschatting, bloedingstijd, stollingstijd en aantal bloedplaatjes werden uitgevoerd. Miltafzuiging werd alleen uitgevoerd bij degenen die niet ernstig anemisch waren (Hb ≥ 6 mg/dl) en een aantal bloedplaatjes hadden van >50.000/microliter bloed. De protrombinetijd werd ook gecontroleerd vóór miltaspiratie en degenen met een PT van meer dan 4 seconden verlengd kwamen niet in aanmerking voor het onderzoek. Alle noodzakelijke behandelingen werden gegeven in het geval van een bloeding na de procedure, inclusief bloedtransfusie. Indien nodig worden de patiënten ook vervoerd naar Mymensingh Medical College Hospital, voor meer gespecialiseerde behandeling en ondersteuning.

Behandeling en opvolging

In Bangladesh is intramusculaire toediening van natriumantimoongluconaat (SAG; Albert David Ltd., India), in een dosis van 20 mg/kg lichaamsgewicht, met een maximale dosis van 850 mg/dag, gedurende achtentwintig dagen de huidige standaardbehandeling voor patiënten met KA. De hartslag en ademhaling, bloeddruk en temperatuur werden tijdens deze behandelingsperiode om de 12 uur gecontroleerd. ECG werd uitgevoerd indien klinisch geïndiceerd. De behandeling werd stopgezet als zich tekenen van ernstige toxiciteit (cardiotoxiciteit, nierfalen enz.) ontwikkelden en de patiënt was behandeld met een standaarddosis amfotericine B.

Ziekenhuisopname: Alle patiënten onder behandeling werd aangeboden om gedurende de gehele behandelingsperiode met SAG in het Community-based Medical College Hospital te verblijven. De patiënten waren in het ziekenhuis opgenomen voor behandeling met amfotericine B in geval van falen van de behandeling of toxiciteit met SAG.

Follow-up: aan het einde van de behandeling werden de patiënten beoordeeld op genezing door lichamelijk onderzoek en miltafzuiging. De proefpersonen volgden zes maanden zoals weergegeven in Schema-2.

Diagnostische tests die moeten worden geëvalueerd

rK39-peilstoktest Voor de rK39-peilstoktest werd een bloedmonster met een vingerprik afgenomen in capillaire buisjes. Deze methode is snel en tijdbesparend.

Parasitologische diagnose

Miltaspiraat werd gebruikt voor parasitologische diagnose. Er werd een objectglaasje met miltaspiraten geprepareerd voor Giemsa-kleuring. Twee laboranten van ICDDR,B werden getraind in kleurtechnieken en het lezen van de objectglaasjes. Willekeurig geselecteerde objectglaasjes waren voor kwaliteitscontrole naar referentielaboratoria elders gestuurd.

Polymerase kettingreactie (PCR)

DNA van Leishmania donovani in de verzamelde bloedmonsters was gedetecteerd met behulp van de methoden beschreven door Salotra et al.

Monsterafname en DNA-isolatie: Het verzamelde bloedmonster werd naar het Parasitologielaboratorium van ICDDR,B getransporteerd en overgebracht naar 4°C en in het algemeen op dezelfde dag verwerkt. DNA werd geëxtraheerd uit 0,2 ml bloed met behulp van een QIAamp DNA blood mini kit (Qiagen).

PCR-amplificatie: DNA van gekweekte parasieten (1 ng) en van klinische monsters (100 ng) werden genomen voor amplificatie met behulp van de hierboven beschreven LdI-primers. Het reactiemengsel (50 µl) bevatte 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, een concentratie van 200 µM van elk deoxynucleosidetrifosfaat, 50 ng van elke primer en 1,25 U Taq DNA-polymerase (Gibco BRL ). Elk reactiemengsel werd bedekt met minerale olie en amplificatie werd uitgevoerd in een thermische cycler (Perkin-Elmer, Warrington, Groot-Brittannië) geprogrammeerd voor 40 cycli van denaturatie bij 94°C gedurende 1 minuut, annealing bij 45°C gedurende 1 minuut, en verlenging bij 72°C gedurende 2 min, voorafgegaan door een initiële denaturatie van 2 min bij 94°C. Uiteindelijke verlenging was gedurende 3 min bij 72°C. Producten werden geanalyseerd door middel van elektroforese in 1% agarosegel die ethidiumbromide (0,5 µg/ml) in TAE-buffer (0,04 M Tris-acetaat, 0,001 M EDTA) bevatte en gefotografeerd onder UV-belichting.

Mini-exon PCR-RFLP: De mini-exon PCR-RFLP is ontwikkeld door het Swiss Tropical Institute (STI) (Marfurth et al. 2003).

Steekproefgrootteberekening en uitkomstvariabele(n):

De steekproefomvang van 200 casussen en 100 controles is gebaseerd op praktische overwegingen om te voldoen aan de primaire doelstelling van capaciteitsontwikkeling en het onderzoek is niet formeel aangedreven voor het testen van hypothesen. De nadruk bij het onderzoeken van de sensitiviteit en specificiteit van de nieuwe diagnostische tests zal liggen op het presenteren van beschrijvende statistieken en betrouwbaarheidsintervallen.

Gegevensanalyse:

De sensitiviteit (aandeel van correct geïdentificeerde terecht-positieve resultaten) en specificiteit (aandeel van correct geïdentificeerde terecht-negatieve resultaten) werd berekend voor elke diagnostische test, en 95%-betrouwbaarheidsintervallen voor deze verhoudingen waren berekend met behulp van de Wilsons-methode.

De positieve en negatieve voorspellende waarden werden ook berekend met behulp van de methode beschreven door Altman et al. De positief voorspellende waarde is het deel van de patiënten met een positief resultaat voor de experimentele diagnostische test dat door parasitologisch onderzoek correct wordt gediagnosticeerd. Evenzo is de negatief voorspellende waarde het percentage patiënten met een negatief diagnostisch testresultaat dat door parasitologisch onderzoek correct wordt gediagnosticeerd. Het 95%-BI voor de positieve en de negatieve voorspellende waarden was bepaald. Deze parameters zouden het mogelijk maken om elke diagnostische test te vergelijken met het 'gouden standaard' parasitologisch onderzoek.