Пилотное исследование по наращиванию потенциала для многоцентрового рандомизированного исследования лечения Кала Азар в Бангладеш

Конкретные цели:

Основная цель: развитие потенциала для оценки новых схем лечения кала-азар в Бангладеш.

Второстепенные цели:

1. Оценить новые диагностические тесты на кала-азар, включая тест с полосками rK39 в сыворотке; КАТЕКС в моче; и ПЦР (полимеразная цепная реакция) в крови и клинических образцах.
2. Оценить ответ на лечение 28 инъекциями САГ с помощью ПЦР в образцах крови и клинических образцах.
3. Перенести метод ПЦР-ПДРФ с мини-экзонами в ICDDR, B и охарактеризовать наиболее распространенные виды Leishmania в районе Майменсингха и их реакцию на стандартное лечение SAG.
4. Мы также проанализируем, связаны ли определенные генотипы с возникновением PKDL и является ли ПЦР мини-экзона подходящим маркером для мониторинга внутри- и межвидовой генетической эволюции видов Leishmania.

Дизайн и методы исследования:

Пациенты для предлагаемого исследования были отобраны из трех оздоровительных комплексов upazilla в Mymensingh после обсуждения с государственными учреждениями, работающими в этих областях. При необходимости мы пошли бы на активное наблюдение, чтобы набрать необходимое количество субъектов для исследования.

Пациенты

Всего в исследование было включено 200 последовательных случаев (возраст >5 лет), отвечающих следующим диагностическим критериям КА: (i) лихорадка в течение >2 недель; (ii) хотя бы один из следующих критериев: спленомегалия, потемнение кожи и потеря веса; и (iii) положительный тест с полосками rK39. Критерии исключения будут включать: (1) детей в возрасте до пяти лет, (2) беременных женщин и (3) пациентов, одновременно страдающих любым другим серьезным заболеванием, не связанным с кала-азаром. Пациентам (или их родителям/опекунам в случае несовершеннолетних), отвечающим вышеуказанным критериям, врачи-эксперты разъясняли риск лечения САГ и риск, связанный с процедурами аспирации селезенки. Затем перед включением в исследование от пациентов (или их родителей/опекунов в случае несовершеннолетних) было получено информированное согласие (устное или письменное). Сто здоровых людей, проживающих в том же районе, были включены в контрольную группу для оценки ПЦР и других диагностических тестов КА. Наши полевые работники посетили дома в сообществе и взяли образцы крови у здоровых добровольцев с их информированного согласия.

Процедуры исследования и оценки

Селезеночная аспирация:

Аспирация селезенки была выполнена у 200 последовательных пациентов с клиническими признаками КА с положительным тестом на rK39. Аспирацию селезенки выполняли для подтверждения диагноза в 1-й день исследования, а затем еще раз на 29-й день для оценки излечения от заболевания. Таким образом, когда тест с полосками rK39 показал положительный результат, стандартные предпроцедурные тесты на аспирацию селезенки, например. Были выполнены оценка гемоглобина, времени кровотечения, времени свертывания крови и количества тромбоцитов. Аспирацию селезенки выполняли только тем, у кого не было тяжелой анемии (Hb ≥ 6 мг/дл) и количество тромбоцитов >50 000/мкл крови. Протромбиновое время также проверяли перед аспирацией селезенки, и те, у кого протромбиновое время превышало 4 секунды, не подходили для исследования. В случае кровотечения после процедуры проводилось все необходимое лечение, включая переливание крови. При необходимости пациенты также будут доставлены в больницу Медицинского колледжа Мименсингх для более специализированного лечения и поддержки.

Лечение и последующее наблюдение

В Бангладеш внутримышечное введение глюконата сурьмы натрия (SAG; Albert David Ltd., Индия) в дозе 20 мг/кг массы тела с максимальной дозой 850 мг/сут в течение двадцати восьми дней является текущим стандартным лечением. для больных КА. Частоту пульса и дыхания, кровяное давление и температуру контролировали с 12-часовыми интервалами в течение этого периода лечения. ЭКГ выполняли по клиническим показаниям. Лечение прекращали при появлении признаков выраженной токсичности (кардиотоксичность, почечная недостаточность и др.) и пациенту назначали стандартную дозу амфотерицина В.

Госпитализация: всем пациентам, находящимся на лечении, было предложено пребывание в больнице Общинного медицинского колледжа на весь период лечения САГ. Пациенты были госпитализированы для лечения амфотерицином В в случае неэффективности лечения или токсичности САГ.

Последующее наблюдение: в конце лечения пациентов оценивали на предмет излечения с помощью физического осмотра и аспирации селезенки. Субъекты наблюдали в течение шести месяцев, как показано на Схеме-2.

Диагностические тесты, подлежащие оценке

Тест с полосками rK39 Образец крови из пальца собирали в капиллярные пробирки для теста с полосками rK39. Этот метод является быстрым и экономит время.

Паразитологическая диагностика

Аспират селезенки использовали для паразитологической диагностики. Препарат аспирата селезенки готовили для окрашивания по Гимзе. Два лаборанта из ICDDR,B прошли обучение методам окрашивания и чтению слайдов. Случайно выбранные слайды были отправлены в другие справочные лаборатории для контроля качества.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ДНК Leishmania donovani в собранных образцах крови была обнаружена с использованием методов, описанных Salotra et al.

Сбор образцов и выделение ДНК: Собранный образец крови был доставлен в лабораторию паразитологии ICDDR,B, перенесен в помещение с температурой 4°C и обработан, как правило, в тот же день. ДНК экстрагировали из 0,2 мл крови с использованием мини-набора ДНК крови QIAamp (Qiagen).

ПЦР-амплификация: ДНК из культивируемых паразитов (1 нг) и из клинических образцов (100 нг) брали для амплификации с использованием праймеров LdI, описанных выше. Реакционная смесь (50 мкл) содержала 10 мМ трис-HCl (рН 8,3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, концентрацию каждого дезоксинуклеозидтрифосфата 200 мкМ, 50 нг каждого праймера и 1,25 ед. ДНК-полимеразы Taq (Gibco BRL). ). Каждую реакционную смесь покрывали минеральным маслом и проводили амплификацию в термоциклере (Perkin-Elmer, Warrington, Великобритания), запрограммированном на 40 циклов денатурации при 94°С в течение 1 мин, отжига при 45°С в течение 1 мин, и удлинение при 72°С в течение 2 мин, которому предшествует начальная денатурация в течение 2 мин при 94°С. Окончательное удлинение длилось 3 мин при 72°С. Продукты анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (0,5 мкг/мл) в буфере ТАЕ (0,04 М трис-ацетат, 0,001 М ЭДТА) и фотографировали при УФ-освещении.

Миниэкзонная ПЦР-ПДРФ: Миниэкзонная ПЦР-ПДРФ была разработана Швейцарским тропическим институтом (STI) (Marfurth et al. 2003).

Расчет размера выборки и переменная (переменные) результата:

Размер выборки из 200 случаев и 100 контролей основан на практических соображениях для достижения основной цели развития потенциала, и исследование формально не предназначено для проверки гипотез. Акцент при исследовании чувствительности и специфичности новых диагностических тестов будет сделан на представлении описательной статистики и доверительных интервалов.

Анализ данных:

Чувствительность (доля правильно определенных истинно положительных результатов) и специфичность (доля правильно определенных истинно отрицательных результатов) были рассчитаны для каждого диагностического теста, и 95% доверительные интервалы для этих соотношений были рассчитаны с использованием метода Уилсона.

Положительные и отрицательные прогностические значения также рассчитывали с использованием метода, описанного Altman et al. Положительная прогностическая ценность – это доля больных с положительным результатом экспериментального диагностического теста, которым правильно поставлен диагноз при паразитологическом исследовании. Точно так же отрицательная прогностическая ценность - это доля пациентов с отрицательным результатом диагностического теста, которым правильно поставлен диагноз при паразитологическом исследовании. Был определен 95% ДИ для положительных и отрицательных прогностических значений. Эти параметры позволили бы сравнить каждый диагностический тест с «золотым стандартом» паразитологического исследования.