Pilottitutkimus kapasiteetin lisäämiseksi monikeskuksessa, satunnaistetussa kokeessa Kala Azarin hoitoon Bangladeshissa

Erityiset tavoitteet:

Ensisijainen tavoite: Kehittää kykyä arvioida uudempia hoito-ohjelmia kala azarin hoitoon Bangladeshissa.

Toissijaiset tavoitteet:

1. Arvioida uusia diagnostisia testejä kala azarille, mukaan lukien rK39-mittatikkutesti seerumissa; KATEX virtsassa; ja PCR (polymeraasiketjureaktio) veressä ja kliinisissä näytteissä.
2. Arvioida vastetta hoitoon 28 SAG-injektiolla käyttämällä PCR:ää verinäytteissä ja kliinisissä näytteissä.
3. Siirtää mini-eksoni-PCR-RFLP-tekniikka ICDDR,B:hen ja karakterisoida Mymensinghin alueen yleisimmät Leishmania-lajit ja niiden vaste tavanomaiseen SAG-hoitoon.
4. Analysoimme myös, liittyvätkö tietyt genotyypit PKDL:n esiintymiseen ja onko mini-eksoni-PCR sopiva markkeri Leishmania-lajien sisäisen ja lajien välisen geneettisen evoluution seurantaan.

Tutkimussuunnittelu ja menetelmät:

Potilaat ehdotettuun tutkimukseen valittiin kolmesta Mymensinghin upazilla-terveyskeskuksesta keskustelua varten näillä alueilla työskentelevien valtion virastojen kanssa. Tarvittaessa käymme aktiivisessa seurannassa, jotta tutkimukseen kirjattaisiin tarvittava määrä koehenkilöitä.

Potilaat

Kaikkiaan tutkimukseen otettiin 200 peräkkäistä tapausta (ikä > 5 vuotta), jotka täyttivät seuraavat KA:n diagnostiset kriteerit: (i) kuume > 2 viikkoa; (ii) vähintään yksi seuraavista kriteereistä - splenomegalia, ihon tummuminen ja painonpudotus; ja (iii) positiivinen rK39-mittatikkutesti. Poissulkemiskriteereitä ovat: (1) alle viisivuotiaat lapset, (2) raskaana olevat naiset ja (3) potilaat, jotka kärsivät samanaikaisesti mistä tahansa muusta vakavasta sairaudesta, joka ei liity kala azariin. Asiantuntijalääkärit selittivät yllä mainitut kriteerit täyttäville potilaille (tai heidän vanhemmilleen/huoltajilleen, jos he ovat alaikäisiä) SAG-hoidon riskeistä ja pernan aspiraatiotoimenpiteisiin liittyvistä riskeistä. Tietoinen suostumus (suullinen tai kirjallinen) saatiin sitten potilailta (tai heidän vanhemmiltaan/huoltajilta, jos he olivat alaikäisiä) ennen tutkimukseen ottamista. Sata tervettä henkilöä, jotka asuvat samalla alueella, otettiin mukaan kontrolleiksi arvioimaan PCR:ää ja muita KA:n diagnostisia testejä. Kenttätyöntekijämme vierailivat paikkakunnan taloissa ja keräsivät verinäytteitä terveiltä vapaaehtoisilta heidän tietoisella suostumuksellaan.

Tutkimusmenettelyt ja arvioinnit

Pernan aspiraatio:

Pernan aspiraatio suoritettiin 200 peräkkäiselle potilaalle, joille oli todettu KA:n kliinisiä piirteitä positiivisella rK39-mittatikkutestillä. Pernan aspiraatio suoritettiin diagnoosin vahvistamiseksi tutkimuspäivänä 1 ja sitten taas päivänä 29 taudin paranemisen arvioimiseksi. Siten, kun koehenkilön todettiin olevan positiivinen rK39-mittatikkutestillä, suoritetaan tavanomaiset menettelyä edeltävät testit pernan aspiraatiolle, esim. hemoglobiiniarvio, verenvuotoaika, hyytymisaika ja verihiutalemäärät suoritettiin. Pernan aspiraatio suoritettiin vain niille, jotka eivät olleet vakavasti anemiaa (Hb ≥ 6 mg/dl) ja joiden verihiutaleiden määrä oli >50 000/mikrolitra verta. Protrombiiniaika tarkastettiin myös ennen pernan aspiraatiota, ja ne, joiden PT oli pidentynyt yli 4 sekuntia, eivät olleet kelvollisia tutkimukseen. Toimenpiteen jälkeisen verenvuodon varalta annettiin kaikki tarvittava hoito, mukaan lukien verensiirto. Tarvittaessa potilaat kuljetetaan myös Mymensingh Medical College Hospitaliin erikoistuneen hoidon ja tuen saamiseksi.

Hoito ja seuranta

Bangladeshissa natriumantimoniglukonaatin (SAG; Albert David Ltd., Intia) lihaksensisäinen anto annoksena 20 mg/kg ruumiinpainoa ja enimmäisannos 850 mg/vrk 28 päivän ajan on nykyinen standardihoito. KA-potilaille. Pulssia ja hengitystiheyttä, verenpainetta ja lämpötilaa tarkkailtiin 12 tunnin välein tämän hoitojakson aikana. EKG tehtiin, jos se oli kliinisesti aiheellista. Hoito lopetettiin, jos vakavan toksisuuden merkkejä (sydäntoksisuus, munuaisten vajaatoiminta jne.) ilmaantui, ja potilasta oli hoidettu amfoterisiini B:n vakioannoksella.

Sairaalahoito: Kaikille hoidossa oleville potilaille tarjottiin oleskelua yhteisöpohjaisessa Medical College Hospitalissa koko SAG-hoidon ajan. Potilaat oli viety sairaalaan amfoterisiini B -hoitoa varten hoidon epäonnistumisen tai SAG-toksisuuden vuoksi.

Seuranta: Hoidon lopussa potilaiden paraneminen arvioitiin fyysisellä tutkimuksella ja pernan aspiraatiolla. Koehenkilöt olivat seuranneet kuusi kuukautta kaavion 2 mukaisesti.

Arvioitavat diagnostiset testit

rK39-mittatikkutesti Sormenpistokeverinäyte kerättiin kapillaariputkiin rK39-mittatikkutestiä varten. Tämä menetelmä on nopea ja aikaa säästävä.

Parasitologinen diagnoosi

Pernan aspiraattia käytettiin parasitologiseen diagnoosiin. Giemsa-värjäystä varten valmistettiin objektilasi pernan aspiraateista. Kaksi ICDDR,B:n laboratorioteknikkoa koulutettiin värjäystekniikoihin ja objektilasien lukemiseen. Satunnaisesti valitut diat oli lähetetty vertailulaboratorioihin muualla laadunvalvontaa varten.

Polymeraasiketjureaktio (PCR)

Leishmania donovani -bakteerin DNA kerätyistä verinäytteistä oli havaittu Salotran et ai.

Näytteenotto ja DNA:n eristäminen: Kerätty verinäyte kuljetettiin ICDDR,B:n parasitologialaboratorioon ja siirrettiin 4 °C:seen ja käsiteltiin yleensä samana päivänä. DNA uutettiin 0,2 ml:sta verta käyttämällä QIAamp DNA -veriminipakkausta (Qiagen).

PCR-monistus: DNA:ta viljellyistä loisista (1 ng) ja kliinisistä näytteistä (100 ng) otettiin monistusta varten käyttämällä edellä kuvattuja Ldl-alukkeita. Reaktioseos (50 µl) sisälsi 10 mM Tris-HCl:a (pH 8,3), 50 mM KCl:a, 1,5 mM MgCl2:a, 200 uM konsentraation kutakin deoksinukleosiditrifosfaattia, 50 ng kutakin aluketta ja 1,25 U Taqb DNAcoRL -polymeraasia (Taqb DNAcoRL). ). Jokainen reaktioseos peitettiin mineraaliöljyllä ja monistus suoritettiin lämpösyklilaitteessa (Perkin-Elmer, Warrington, Iso-Britannia), joka oli ohjelmoitu 40 denaturointisyklille 94 °C:ssa 1 minuutin ajan, lämpökäsittelyssä 45 °C:ssa 1 minuutin ajan, ja pidentäminen 72 °C:ssa 2 minuutin ajan, jota edeltää 2 minuutin alkudenaturaatio 94 °C:ssa. Lopullinen pidennys oli 3 minuuttia 72 °C:ssa. Tuotteet analysoitiin elektroforeesilla 1-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka sisälsi etidiumbromidia (0,5 ug/ml) TAE-puskurissa (0,04 M Tris-asetaatti, 0,001 M EDTA) ja valokuvattiin UV-valossa.

Mini-eksoni PCR-RFLP: Mini-eksonin PCR-RFLP oli kehittänyt Swiss Tropical Institute (STI) (Marfurth et al. 2003).

Otoskoon laskelma ja tulosmuuttujat:

Otoskoko 200 tapausta ja 100 kontrollia perustuu käytännön näkökohtiin kapasiteetin kehittämisen ensisijaisen tavoitteen saavuttamiseksi, eikä tutkimuksella ole muodollisesti tehoa hypoteesien testaamiseen. Uusien diagnostisten testien herkkyyden ja spesifisyyden tutkimisen painopiste on kuvaavien tilastojen ja luottamusvälien esittämisessä.

Tietojen analysointi:

Herkkyys (oikein tunnistettujen todellisten positiivisten tulosten osuus) ja spesifisyys (oikein tunnistettujen todellisten negatiivisten tulosten osuus) laskettiin jokaiselle diagnostiselle testille, ja näiden osuuksien 95 %:n luottamusvälit oli laskettu Wilsons-menetelmällä.

Positiiviset ja negatiiviset ennustavat arvot laskettiin myös Altmanin et al. Positiivinen ennustearvo on niiden potilaiden osuus, jotka ovat saaneet positiivisen tuloksen kokeellisessa diagnostisessa testissä ja jotka on diagnosoitu oikein parasitologisella tutkimuksella. Samoin negatiivinen ennustearvo on niiden potilaiden osuus, joiden diagnostinen testitulos on negatiivinen ja jotka on diagnosoitu oikein parasitologisella tutkimuksella. Positiivisten ja negatiivisten ennustusarvojen 95 % luottamusväli oli määritetty. Nämä parametrit mahdollistaisivat kunkin diagnostisen testin vertailun "kultastandardin" parasitologiseen tutkimukseen.