Um estudo piloto para capacitação para um estudo randomizado multicêntrico para tratamento de Kala Azar em Bangladesh

Objetivos Específicos:

Objetivo primário: Desenvolver a capacidade de avaliar novos regimes de tratamento de calazar em Bangladesh.

Objetivos secundários:

1. Avaliar novos testes de diagnóstico para kala azar, incluindo teste rK39 dipstick no soro; KATEX na urina; e PCR (reação em cadeia da polimerase) em sangue e amostras clínicas.
2. Avaliar a resposta ao tratamento com 28 injeções de SAG usando PCR em amostras de sangue e amostras clínicas.
3. Transferir a técnica de mini-exon PCR-RFLP para ICDDR,B e caracterizar as espécies de Leishmania mais prevalentes na área de Mymensingh e sua resposta ao tratamento padrão com SAG.
4. Também analisaremos se determinados genótipos estão associados à ocorrência de PKDL e se o mini-exon PCR é um marcador adequado para monitorar a evolução genética intra e interespécies de espécies de Leishmania.

Projeto de Pesquisa e Métodos:

Os pacientes para o estudo proposto foram selecionados em três complexos de saúde upazilla em Mymensingh por discussão com as agências governamentais que trabalham nessas áreas. Se necessário, iríamos para a vigilância ativa para registrar o número necessário de indivíduos para o estudo.

Pacientes

No total, 200 casos consecutivos (idade > 5 anos) que atenderam aos seguintes critérios diagnósticos para KA foram incluídos no estudo: (i) febre por > 2 semanas; (ii) pelo menos um dos seguintes critérios - esplenomegalia, escurecimento da pele e perda de peso; e (iii) um teste de vareta rK39 positivo. Os critérios de exclusão incluirão: (1) crianças com menos de cinco anos de idade, (2) mulheres grávidas e (3) pacientes que sofram simultaneamente de qualquer outra doença grave não relacionada ao calazar. Pacientes (ou seus pais/responsáveis ​​no caso de menores de idade) que atendessem aos critérios acima, foram explicados sobre o risco do tratamento com SAG e o risco envolvido em procedimentos de aspiração esplênica por médicos especialistas. O consentimento informado (verbal ou escrito) foi então obtido dos pacientes (ou de seus pais/responsáveis ​​no caso de menores de idade) antes da inclusão no estudo. Cem indivíduos saudáveis ​​que vivem na mesma área foram incluídos como controles para avaliação de PCR e outros testes diagnósticos de KA. Nossos trabalhadores de campo visitaram casas na comunidade e coletaram amostras de sangue de voluntários saudáveis ​​com seu consentimento informado.

Procedimentos de estudo e avaliações

Aspiração esplênica:

A aspiração esplênica foi realizada em 200 pacientes consecutivos que apresentavam características clínicas de KA com um teste de vareta rK39 positivo. A aspiração esplênica foi realizada para confirmação do diagnóstico no dia 1 do estudo e novamente no dia 29 para avaliar a cura da doença. Assim, quando um indivíduo foi considerado positivo pelo teste de vareta rK39, testes padrão pré-procedimento para aspiração esplênica, por exemplo. estimativa de hemoglobina, tempo de sangramento, tempo de coagulação e contagem de plaquetas foram realizados. A aspiração esplênica foi realizada apenas naqueles que não apresentavam anemia grave (Hb ≥ 6 mg/dl) e apresentavam contagem de plaquetas >50.000/microlitro de sangue. O tempo de protrombina também foi verificado antes da aspiração esplênica e aqueles com PT prolongado por mais de 4 segundos não foram elegíveis para o estudo. Todo o tratamento necessário foi fornecido em caso de hemorragia após o procedimento, incluindo transfusão de sangue. Se necessário, os pacientes também serão transportados para o Mymensingh Medical College Hospital, para tratamento e suporte mais especializados.

Tratamento e acompanhamento

Em Bangladesh, a administração intramuscular de gluconato de antimônio sódico (SAG; Albert David Ltd., Índia), na dose de 20 mg/kg de peso corporal, com dose máxima de 850 mg/dia, por vinte e oito dias é o tratamento padrão atual para pacientes com CA. O pulso e as frequências respiratórias, as pressões sanguíneas e a temperatura foram monitorizadas em intervalos de 12 horas durante este período de tratamento. EKG foram realizados se clinicamente indicado. O tratamento foi interrompido se sinais de toxicidade grave (cardiotoxicidade, insuficiência renal etc.)

Hospitalização: Todos os pacientes em tratamento foram oferecidos para permanecer no Community-based Medical College Hospital durante todo o período de tratamento com SAG. Os pacientes haviam sido internados para tratamento com anfotericina B em caso de falha terapêutica ou toxicidade com SAG.

Acompanhamento: Ao final do tratamento, os pacientes foram avaliados quanto à cura por meio de exame físico e aspiração esplênica. Os sujeitos estavam acompanhando por seis meses, conforme mostrado no Esquema-2.

Exames diagnósticos a serem avaliados

Teste de vareta rK39 Uma amostra de sangue de picada no dedo foi coletada em tubos capilares para o teste de vareta rK39. Este método é rápido e economiza tempo.

Diagnóstico parasitológico

O aspirado esplênico foi utilizado para diagnóstico parasitológico. Uma lâmina de aspirados esplênicos foi preparada para coloração com Giemsa. Dois técnicos de laboratório do ICDDR,B foram treinados em técnicas de coloração e leitura das lâminas. Lâminas selecionadas aleatoriamente foram enviadas para laboratórios de referência em outros lugares para controle de qualidade.

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

O DNA de Leishmania donovani nas amostras de sangue coletadas foi detectado usando os métodos descritos por Salotra et al.

Coleta de amostra e isolamento de DNA: A amostra de sangue coletada foi transportada para o Laboratório de Parasitologia do ICDDR,B, e transferida para 4°C e processada geralmente no mesmo dia. O DNA foi extraído de 0,2 ml de sangue usando um mini kit QIAamp DNA blood (Qiagen).

Amplificação por PCR: DNA de parasitas cultivados (1 ng) e de amostras clínicas (100 ng) foram coletados para amplificação usando os primers LdI descritos acima. A mistura de reação (50 µl) continha 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, uma concentração de 200 µM de cada desoxinucleosídeo trifosfato, 50 ng de cada iniciador e 1,25 U de Taq DNA polimerase (Gibco BRL ). Cada mistura de reação foi coberta com óleo mineral e a amplificação foi realizada em termociclador (Perkin-Elmer, Warrington, Grã-Bretanha) programado para 40 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 min, anelamento a 45°C por 1 min, e extensão a 72°C por 2 min, precedida por uma desnaturação inicial de 2 min a 94°C. A extensão final foi de 3 minutos a 72°C. Os produtos foram analisados ​​por eletroforese em gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio (0,5 µg/ml) em tampão TAE (acetato Tris 0,04 M, EDTA 0,001 M) e fotografados sob iluminação UV.

Mini-exon PCR-RFLP: O mini-exon PCR-RFLP foi desenvolvido pelo Swiss Tropical Institute (STI) (Marfurth et al. 2003).

Cálculo do tamanho da amostra e variável(ões) de resultado:

O tamanho da amostra de 200 casos e 100 controles é baseado em considerações práticas para atingir o objetivo principal de desenvolvimento de capacidade e o estudo não é formalmente alimentado para testes de hipóteses. A ênfase na investigação da sensibilidade e especificidade dos novos testes diagnósticos será na apresentação de estatísticas descritivas e intervalos de confiança.

Análise de dados:

A sensibilidade (proporção de resultados verdadeiros positivos corretamente identificados) e especificidade (proporção de resultados verdadeiros negativos corretamente identificados) foram calculadas para cada teste diagnóstico, e intervalos de confiança de 95% para essas proporções foram calculados usando o método de Wilson.

Os valores preditivos positivo e negativo também foram calculados pelo método descrito por Altman et al. O valor preditivo positivo é a proporção de pacientes com resultado positivo para o teste diagnóstico experimental que são corretamente diagnosticados pelo exame parasitológico. Da mesma forma, o valor preditivo negativo é a proporção de pacientes com resultado de teste diagnóstico negativo que são diagnosticados corretamente pelo exame parasitológico. Foi determinado o IC de 95% para os valores preditivos positivo e negativo. Esses parâmetros permitiriam a comparação de cada teste diagnóstico com o exame parasitológico 'padrão ouro'.