Badanie pilotażowe dotyczące budowania zdolności w wieloośrodkowej, randomizowanej próbie leczenia Kala Azar w Bangladeszu

Cele szczegółowe:

Główny cel: rozwinięcie zdolności do oceny nowszych schematów leczenia kala azar w Bangladeszu.

Cele drugorzędne:

1. Ocena nowych testów diagnostycznych dla kala azar, w tym testu paskowego rK39 w surowicy; KATEX w moczu; i PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) we krwi i próbkach klinicznych.
2. Ocena odpowiedzi na leczenie za pomocą 28 wstrzyknięć SAG przy użyciu metody PCR w próbkach krwi i próbkach klinicznych.
3. Przeniesienie techniki mini-exon PCR-RFLP do ICDDR,B i scharakteryzowanie najbardziej rozpowszechnionych gatunków Leishmania w rejonie Mymensingh oraz ich odpowiedzi na standardowe leczenie SAG.
4. Przeanalizujemy również, czy określone genotypy są związane z występowaniem PKDL oraz czy mini-exon PCR jest odpowiednim markerem do monitorowania wewnątrz- i międzygatunkowej ewolucji genetycznej gatunków Leishmania.

Projekt badawczy i metody:

Pacjenci do proponowanego badania zostali wybrani z trzech kompleksów zdrowotnych upazilla w Mymensingh po dyskusji z agencjami rządowymi pracującymi na tych obszarach. W razie potrzeby podjęlibyśmy aktywną obserwację w celu zapisania wymaganej liczby osób do badania.

Pacjenci

W sumie do badania włączono 200 kolejnych przypadków (w wieku >5 lat) spełniających następujące kryteria diagnostyczne KA: (i) gorączka utrzymująca się >2 tygodnie; (ii) co najmniej jedno z następujących kryteriów – splenomegalia, ciemnienie skóry i utrata masy ciała; oraz (iii) dodatni wynik testu paskowego rK39. Kryteria wykluczenia obejmują: (1) dzieci poniżej piątego roku życia, (2) kobiety w ciąży oraz (3) pacjentów, którzy jednocześnie cierpią na jakąkolwiek inną poważną chorobę niezwiązaną z kala azar. Pacjenci (lub ich rodzice/opiekunowie w przypadku osób niepełnoletnich) spełniający powyższe kryteria zostali wyjaśnieni przez lekarzy specjalistów o ryzyku leczenia SAG oraz ryzyku związanym z zabiegami aspiracji śledziony. Następnie uzyskano świadomą zgodę (ustną lub pisemną) od pacjentów (lub ich rodziców/opiekunów w przypadku nieletnich) przed włączeniem do badania. Sto zdrowych osób mieszkających na tym samym obszarze zostało włączonych jako kontrole do oceny PCR i innych testów diagnostycznych KA. Nasi pracownicy terenowi odwiedzili domy w społeczności i pobrali próbki krwi od zdrowych ochotników za ich świadomą zgodą.

Procedury badawcze i oceny

Aspiracja śledziony:

Aspirację śledziony wykonano u 200 kolejnych pacjentów, u których stwierdzono kliniczne cechy KA z dodatnim wynikiem testu paskowego rK39. Aspirację śledziony przeprowadzono w celu potwierdzenia rozpoznania w dniu badania 1, a następnie ponownie w dniu 29 w celu oceny wyleczenia z choroby. Tak więc, gdy wynik testu paskowego rK39 u osobnika okazał się pozytywny, standardowe testy poprzedzające procedurę aspiracji śledziony, np. wykonano oznaczenie stężenia hemoglobiny, czasu krwawienia, czasu krzepnięcia i liczby płytek krwi. Aspirację śledziony wykonywano tylko u osób, które nie miały ciężkiej anemii (Hb ≥ 6 mg/dl) i miały liczbę płytek krwi >50 000/mikrolitr krwi. Czas protrombinowy był również sprawdzany przed aspiracją śledziony, a osoby z PT dłuższym niż 4 sekundy nie kwalifikowały się do badania. Zapewniono wszelkie niezbędne leczenie w przypadku krwotoku po zabiegu, w tym transfuzję krwi. W razie potrzeby pacjenci będą również transportowani do szpitala Mymensingh Medical College Hospital w celu bardziej specjalistycznego leczenia i wsparcia.

Leczenie i obserwacja

W Bangladeszu podawanie domięśniowe glukonianu antymonu sodu (SAG; Albert David Ltd., Indie) w dawce 20 mg/kg masy ciała, z maksymalną dawką 850 mg/dobę, przez dwadzieścia osiem dni jest obecnie standardem leczenia dla pacjentów z KA. Tętno i częstość oddechów, ciśnienie krwi i temperaturę monitorowano w odstępach 12-godzinnych podczas tego okresu leczenia. W przypadku wskazań klinicznych wykonano EKG. Leczenie przerywano w przypadku wystąpienia objawów ciężkiej toksyczności (kardiotoksyczność, niewydolność nerek itp.), a pacjent był leczony standardową dawką amfoterycyny B.

Hospitalizacja: Wszystkim leczonym pacjentom zaproponowano pobyt w Środowiskowym Szpitalu Kolegium Medycznego na cały okres leczenia SAG. Pacjenci byli hospitalizowani w celu leczenia amfoterycyną B w przypadku niepowodzenia leczenia lub toksyczności SAG.

Kontynuacja: Pod koniec leczenia pacjentów oceniano pod kątem wyleczenia za pomocą badania fizykalnego i aspiracji śledziony. Badani obserwowali przez sześć miesięcy, jak pokazano na schemacie 2.

Testy diagnostyczne do oceny

Test paskowy rK39 Próbkę krwi pobrano z palca do rurek kapilarnych do testu paskowego rK39. Ta metoda jest szybka i oszczędza czas.

Diagnostyka parazytologiczna

Do diagnostyki parazytologicznej wykorzystano aspirat śledziony. Przygotowano szkiełko aspiratów śledziony do barwienia metodą Giemsy. Dwóch techników laboratoryjnych z ICDDR, B zostało przeszkolonych w zakresie technik barwienia i czytania preparatów. Losowo wybrane preparaty zostały wysłane do innych laboratoriów referencyjnych w celu kontroli jakości.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

DNA Leishmania donovani w pobranych próbkach krwi wykryto metodami opisanymi przez Salotra et al.

Pobieranie próbek i izolacja DNA: Zebraną próbkę krwi przetransportowano do Laboratorium Parazytologii ICDDR, B, przeniesiono do 4°C i przetwarzano zasadniczo tego samego dnia. DNA ekstrahowano z 0,2 ml krwi przy użyciu minizestawu QIAamp DNA blood mini kit (Qiagen).

Amplifikacja PCR: DNA z hodowanych pasożytów (1 ng) iz próbek klinicznych (100 ng) pobrano do amplifikacji przy użyciu starterów LdI opisanych powyżej. Mieszanina reakcyjna (50 µl) zawierała 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, stężenie 200 µM każdego trifosforanu deoksynukleozydu, 50 ng każdego startera i 1,25 U polimerazy DNA Taq (Gibco BRL ). Każdą mieszaninę reakcyjną pokryto olejem mineralnym i przeprowadzono amplifikację w termocyklerze (Perkin-Elmer, Warrington, Wielka Brytania) zaprogramowanym na 40 cykli denaturacji w 94°C przez 1 min, wygrzewania w 45°C przez 1 min, i wydłużanie w 72°C przez 2 min, poprzedzone wstępną denaturacją przez 2 min w 94°C. Końcowe wydłużanie trwało 3 minuty w temperaturze 72°C. Produkty analizowano metodą elektroforezy w 1% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny (0,5 ug/ml) w buforze TAE (0,04 M octan Tris, 0,001 M EDTA) i fotografowano w świetle UV.

Mini-ekson PCR-RFLP: Mini-ekson PCR-RFLP został opracowany przez Szwajcarski Instytut Tropikalny (STI) (Marfurth et al. 2003).

Obliczenia wielkości próby i zmienne wyniku:

Wielkość próby 200 przypadków i 100 kontroli opiera się na praktycznych rozważaniach dotyczących spełnienia głównego celu, jakim jest rozwój zdolności, a badanie nie jest formalnie zasilane do testowania hipotez. W badaniu czułości i specyficzności nowych testów diagnostycznych nacisk zostanie położony na przedstawienie statystyk opisowych i przedziałów ufności.

Analiza danych:

Dla każdego testu diagnostycznego obliczono czułość (odsetek prawidłowo zidentyfikowanych wyników prawdziwie dodatnich) i swoistość (odsetek prawidłowo zidentyfikowanych wyników prawdziwie ujemnych), a dla tych proporcji obliczono 95% przedziały ufności metodą Wilsona.

Dodatnie i ujemne wartości predykcyjne obliczono również przy użyciu metody opisanej przez Altmana i in. Dodatnia wartość predykcyjna to odsetek pacjentów z dodatnim wynikiem eksperymentalnego testu diagnostycznego, u których prawidłowo zdiagnozowano badanie parazytologiczne. Podobnie ujemna wartość predykcyjna to odsetek pacjentów z ujemnym wynikiem testu diagnostycznego, u których prawidłowo zdiagnozowano badanie parazytologiczne. Określono 95% przedział ufności dla dodatnich i ujemnych wartości predykcyjnych. Parametry te pozwoliłyby na porównanie każdego testu diagnostycznego z badaniem parazytologicznym „złotego standardu”.