Eine Pilotstudie zum Kapazitätsaufbau für eine multizentrische, randomisierte Studie zur Behandlung von Kala Azar in Bangladesch

Spezifische Ziele:

Primäres Ziel: Aufbau von Kapazitäten zur Bewertung neuerer Schemata zur Behandlung von Kala Azar in Bangladesch.

Sekundäre Ziele:

1. Bewertung neuartiger diagnostischer Tests für Kala Azar, einschließlich des rK39-Teststäbchens im Serum; KATEX im Urin; und PCR (Polymerase-Kettenreaktion) in Blut und klinischen Proben.
2. Bewertung des Ansprechens auf die Behandlung mit 28 Injektionen von SAG unter Verwendung von PCR in Blutproben und klinischen Proben.
3. Übertragung der Mini-Exon-PCR-RFLP-Technik auf ICDDR,B und Charakterisierung der am weitesten verbreiteten Leishmania-Spezies im Gebiet von Mymensingh und ihrer Reaktion auf die Standardbehandlung mit SAG.
4. Wir werden auch analysieren, ob bestimmte Genotypen mit dem Auftreten von PKDL assoziiert sind und ob die Mini-Exon-PCR ein geeigneter Marker ist, um die intra- und interspezies genetische Evolution von Leishmania-Arten zu überwachen.

Forschungsdesign und Methoden:

Die Patienten für die vorgeschlagene Studie wurden aus drei Upazilla-Gesundheitskomplexen in Mymensingh durch Gespräche mit den in diesen Bereichen tätigen Regierungsbehörden ausgewählt. Falls erforderlich, würden wir uns für eine aktive Überwachung entscheiden, um die erforderliche Anzahl von Probanden für die Studie einzuschreiben.

Patienten

Insgesamt wurden 200 aufeinanderfolgende Fälle (Alter > 5 Jahre), die die folgenden diagnostischen Kriterien für KA erfüllten, in die Studie aufgenommen: (i) Fieber für > 2 Wochen; (ii) mindestens eines der folgenden Kriterien – Splenomegalie, Verdunkelung der Haut und Gewichtsverlust; und (iii) ein positiver rK39-Messstabtest. Zu den Ausschlusskriterien gehören: (1) Kinder unter fünf Jahren, (2) schwangere Frauen und (3) Patienten, die gleichzeitig an einer anderen schweren Krankheit leiden, die nicht mit Kala Azar in Zusammenhang steht. Patienten (oder ihre Eltern/Erziehungsberechtigten bei Minderjährigen), die die oben genannten Kriterien erfüllen, wurden von Fachärzten über das Risiko einer Behandlung mit SAG und das Risiko einer Milzpunktion aufgeklärt. Die informierte Zustimmung (mündlich oder schriftlich) wurde dann von den Patienten (oder ihren Eltern/Erziehungsberechtigten im Falle von Minderjährigen) vor dem Einschluss in die Studie eingeholt. Einhundert gesunde Individuen, die im selben Gebiet lebten, wurden als Kontrollen für die Bewertung von PCR und anderen diagnostischen Tests von KA aufgenommen. Unsere Außendienstmitarbeiter besuchten Häuser in der Gemeinde und sammelten Blutproben von den gesunden Freiwilligen mit ihrer informierten Zustimmung.

Studienablauf und Leistungsbewertung

Milzaspiration:

Bei 200 konsekutiven Patienten, bei denen klinische Merkmale von KA mit positivem rK39-Teststreifen aufgetreten waren, wurde eine Milzaspiration durchgeführt. Zur Bestätigung der Diagnose wurde am Studientag 1 eine Milzaspiration durchgeführt und dann erneut am Tag 29, um die Heilung der Krankheit zu beurteilen. Wenn also eine Testperson durch den rK39-Stabtest als positiv befunden wurde, wurden standardmäßige Vorverfahrenstests für die Milzaspiration, z. Hämoglobinschätzung, Blutungszeit, Gerinnungszeit und Thrombozytenzahlen wurden durchgeführt. Eine Milzaspiration wurde nur bei Patienten durchgeführt, die nicht schwer anämisch waren (Hb ≥ 6 mg/dl) und eine Thrombozytenzahl von > 50.000/Mikroliter Blut aufwiesen. Die Prothrombinzeit wurde auch vor der Milzaspiration überprüft, und Patienten mit einer um mehr als 4 Sekunden verlängerten PT kamen für die Studie nicht in Frage. Im Falle einer Blutung nach dem Eingriff wurden alle notwendigen Behandlungen, einschließlich Bluttransfusionen, bereitgestellt. Falls erforderlich, werden die Patienten auch zur spezialisierteren Behandlung und Unterstützung in das Mymensingh Medical College Hospital transportiert.

Behandlung und Nachsorge

In Bangladesch ist die intramuskuläre Verabreichung von Natriumantimongluconat (SAG; Albert David Ltd., Indien) in einer Dosis von 20 mg/kg Körpergewicht mit einer maximalen Dosis von 850 mg/Tag für 28 Tage die derzeitige Standardbehandlung für Patienten mit KA. Die Puls- und Atemfrequenz, der Blutdruck und die Temperatur wurden während dieser Behandlungsperiode in 12-Stunden-Intervallen überwacht. Bei klinischer Indikation wurde ein EKG durchgeführt. Die Behandlung wurde abgebrochen, wenn Anzeichen einer schweren Toxizität (Kardiotoxizität, Nierenversagen usw.) auftraten und der Patient mit einer Standarddosis von Amphotericin B behandelt worden war.

Krankenhausaufenthalt: Allen behandelten Patienten wurde angeboten, während der gesamten Behandlungsdauer mit SAG im Community-based Medical College Hospital zu bleiben. Die Patienten waren im Falle eines Behandlungsversagens oder einer Toxizität von SAG zur Behandlung mit Amphotericin B ins Krankenhaus eingeliefert worden.

Nachsorge: Am Ende der Behandlung wurden die Patienten durch körperliche Untersuchung und Milzpunktion auf Heilung untersucht. Die Probanden folgten sechs Monate lang, wie in Schema-2 gezeigt.

Auszuwertende diagnostische Tests

rK39-Messstabtest Für den rK39-Messstabtest wurde eine Blutprobe durch Fingereinstich in Kapillarröhrchen entnommen. Diese Methode ist schnell und zeitsparend.

Parasitologische Diagnose

Milzaspirat wurde für die parasitologische Diagnose verwendet. Ein Objektträger von Milzaspiraten wurde für die Giemsa-Färbung vorbereitet. Zwei Labortechniker von ICDDR, B wurden in Färbetechniken und dem Lesen der Objektträger geschult. Zufällig ausgewählte Objektträger wurden zur Qualitätskontrolle an andere Referenzlabore geschickt.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

DNA von Leishmania donovani war in den gesammelten Blutproben unter Verwendung der von Salotra et al.

Probenentnahme und DNA-Isolierung: Die gesammelten Blutproben wurden zum Parasitologie-Labor des ICDDR, B transportiert, auf 4 °C gebracht und im Allgemeinen am selben Tag verarbeitet. DNA wurde aus 0,2 ml Blut unter Verwendung eines QIAamp-DNA-Blut-Minikits (Qiagen) extrahiert.

PCR-Amplifikation: DNA aus kultivierten Parasiten (1 ng) und aus klinischen Proben (100 ng) wurden zur Amplifikation unter Verwendung der oben beschriebenen LdI-Primer entnommen. Das Reaktionsgemisch (50 µl) enthielt 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, eine Konzentration von 200 µM von jedem Desoxynucleosidtriphosphat, 50 ng von jedem Primer und 1,25 U Taq-DNA-Polymerase (Gibco BRL ). Jedes Reaktionsgemisch wurde mit Mineralöl überschichtet, und die Amplifikation wurde in einem Thermocycler (Perkin-Elmer, Warrington, Großbritannien) durchgeführt, der für 40 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 1 Minute, Annealing bei 45 °C für 1 Minute programmiert war, und Extension bei 72°C für 2 min, gefolgt von einer anfänglichen Denaturierung von 2 min bei 94°C. Die endgültige Extension erfolgte für 3 min bei 72°C. Die Produkte wurden durch Elektrophorese in 1 % Agarosegel, das Ethidiumbromid (0,5 &mgr;g/ml) in TAE-Puffer (0,04 M Trisacetat, 0,001 M EDTA) enthielt, analysiert und unter UV-Beleuchtung fotografiert.

Mini-Exon-PCR-RFLP: Das Mini-Exon-PCR-RFLP wurde vom Schweizerischen Tropeninstitut (STI) entwickelt (Marfurth et al. 2003).

Berechnung der Stichprobengröße und Ergebnisvariable(n):

Die Stichprobengröße von 200 Fällen und 100 Kontrollen basiert auf praktischen Erwägungen zum Erreichen des primären Ziels der Kapazitätsentwicklung, und die Studie ist formal nicht für Hypothesentests ausgelegt. Der Schwerpunkt bei der Untersuchung von Sensitivität und Spezifität der neuen diagnostischen Tests wird auf der Darstellung deskriptiver Statistiken und Konfidenzintervalle liegen.

Datenanalyse:

Die Sensitivität (Anteil richtig identifizierter richtig positiver Ergebnisse) und Spezifität (Anteil richtig identifizierter richtig negativer Ergebnisse) wurde für jeden diagnostischen Test berechnet, und 95 %-Konfidenzintervalle für diese Anteile wurden nach der Wilson-Methode berechnet.

Die positiven und negativen prädiktiven Werte wurden ebenfalls unter Verwendung der von Altman et al. beschriebenen Methode berechnet. Der positive prädiktive Wert ist der Anteil der Patienten mit positivem Ergebnis der experimentellen Diagnostik, die durch die parasitologische Untersuchung richtig diagnostiziert werden. Ebenso ist der negative prädiktive Wert der Anteil der Patienten mit einem negativen diagnostischen Testergebnis, die durch eine parasitologische Untersuchung korrekt diagnostiziert werden. Das 95 %-KI für den positiven und den negativen prädiktiven Wert wurde bestimmt. Diese Parameter würden den Vergleich jedes diagnostischen Tests mit der parasitologischen „Goldstandard“-Untersuchung ermöglichen.