Uno studio pilota per il rafforzamento delle capacità per una sperimentazione randomizzata multicentrica per il trattamento di Kala Azar in Bangladesh

Obiettivi specifici:

Obiettivo primario: sviluppare la capacità di valutare nuovi regimi per il trattamento del kala azar in Bangladesh.

Obiettivi secondari:

1. Valutare nuovi test diagnostici per il kala azar incluso il test rK39 con dipstick nel siero; KATEX nelle urine; e PCR (reazione a catena della polimerasi) nel sangue e nei campioni clinici.
2. Valutare la risposta al trattamento con 28 iniezioni di SAG utilizzando la PCR in campioni di sangue e campioni clinici.
3. Trasferire la tecnica del mini-esone PCR-RFLP all'ICDDR,B e caratterizzare le specie di Leishmania più diffuse nell'area di Mymensingh e la loro risposta al trattamento standard con SAG.
4. Analizzeremo anche se alcuni genotipi sono associati alla presenza di PKDL e se la PCR mini-exon è un marcatore adatto per monitorare l'evoluzione genetica intra e interspecie delle specie di Leishmania.

Disegno e metodi della ricerca:

I pazienti per lo studio proposto sono stati selezionati da tre complessi sanitari upazilla a Mymensingh per discussione con le agenzie governative che lavorano in queste aree. Se necessario, opteremo per la sorveglianza attiva per arruolare il numero richiesto di soggetti per lo studio.

Pazienti

In totale, sono stati arruolati nello studio 200 casi consecutivi (età >5 anni) che soddisfacevano i seguenti criteri diagnostici per KA: (i) febbre per >2 settimane; (ii) almeno uno dei seguenti criteri: splenomegalia, scurimento della pelle e perdita di peso; e (iii) un test dipstick rK39 positivo. I criteri di esclusione includeranno: (1) bambini di età inferiore ai cinque anni, (2) donne incinte e (3) pazienti che soffrono contemporaneamente di qualsiasi altra malattia grave non correlata al kala azar. Ai pazienti (o ai loro genitori/tutori in caso di minorenni) che soddisfano i criteri di cui sopra, è stato spiegato il rischio del trattamento con SAG e il rischio connesso alle procedure di aspirazione splenica da parte di medici esperti. Il consenso informato (verbale o scritto) è stato quindi ottenuto dai pazienti (o dai loro genitori/tutori in caso di minori) prima dell'inclusione nello studio. Cento individui sani che vivevano nella stessa area sono stati arruolati come controlli per valutare la PCR e altri test diagnostici di KA. I nostri operatori sul campo hanno visitato le case della comunità e raccolto campioni di sangue dai volontari sani con il loro consenso informato.

Procedure e valutazioni dello studio

Aspirazione splenica:

L'aspirazione splenica è stata eseguita in 200 pazienti consecutivi che erano stati presentati con caratteristiche cliniche di KA con un test dipstick rK39 positivo. L'aspirazione splenica è stata eseguita per confermare la diagnosi il giorno 1 dello studio e poi di nuovo il giorno 29 per valutare la cura dalla malattia. Pertanto, quando un soggetto è risultato positivo al test con dipstick rK39, i test pre-procedura standard per l'aspirazione splenica, ad es. sono stati eseguiti la stima dell'emoglobina, il tempo di sanguinamento, il tempo di coagulazione e la conta piastrinica. L'aspirazione splenica è stata eseguita solo in coloro che non erano gravemente anemici (Hb ≥ 6 mg/dl) e avevano una conta piastrinica >50.000/microlitro di sangue. Anche il tempo di protrombina è stato controllato prima dell'aspirazione splenica e quelli con un PT prolungato per più di 4 secondi non erano eleggibili per lo studio. Tutte le cure necessarie sono state fornite in caso di emorragia a seguito della procedura, comprese le trasfusioni di sangue. Se necessario, i pazienti saranno anche trasportati al Mymensingh Medical College Hospital, per cure e supporto più specializzati.

Trattamento e follow-up

In Bangladesh, la somministrazione intramuscolare di sodio antimonio gluconato (SAG; Albert David Ltd., India), alla dose di 20 mg/kg di peso corporeo, con una dose massima di 850 mg/giorno, per ventotto giorni è l'attuale trattamento standard per i pazienti con KA. La frequenza cardiaca e respiratoria, la pressione sanguigna e la temperatura sono state monitorate a intervalli di 12 ore durante questo periodo di trattamento. EKG sono stati eseguiti se clinicamente indicato. Il trattamento è stato interrotto se si sviluppavano segni di grave tossicità (cardiotossicità, insufficienza renale, ecc.) e il paziente era stato trattato con una dose standard di amfotericina B.

Ricovero in ospedale: a tutti i pazienti in trattamento è stato offerto di rimanere presso il Community-based Medical College Hospital per l'intero periodo di trattamento con SAG. I pazienti erano stati ricoverati in ospedale per il trattamento con amfotericina B in caso di fallimento del trattamento o tossicità con SAG.

Follow-up: alla fine del trattamento, i pazienti sono stati valutati per la cura mediante esame fisico e aspirazione splenica. I soggetti seguivano da sei mesi come mostrato nello Schema-2.

Test diagnostici da valutare

Test rK39 con dipstick Un campione di sangue prelevato dal dito è stato raccolto in provette capillari per il test rK39 con dipstick. Questo metodo è rapido e fa risparmiare tempo.

Diagnosi parassitologica

L'aspirato splenico è stato utilizzato per la diagnosi parassitologica. È stato preparato un vetrino di aspirati splenici per la colorazione Giemsa. Due tecnici di laboratorio dell'ICDDR,B sono stati formati sulle tecniche di colorazione e sulla lettura dei vetrini. I vetrini selezionati casualmente erano stati inviati a laboratori di riferimento altrove per il controllo di qualità.

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

Il DNA di Leishmania donovani nei campioni di sangue raccolti era stato rilevato utilizzando i metodi descritti da Salotra et al.

Prelievo del campione e isolamento del DNA: il campione di sangue raccolto è stato trasportato al laboratorio di parassitologia dell'ICDDR, B, trasferito a 4°C e processato generalmente lo stesso giorno. Il DNA è stato estratto da 0,2 ml di sangue utilizzando un mini kit QIAamp DNA blood (Qiagen).

Amplificazione PCR: DNA da parassiti in coltura (1 ng) e da campioni clinici (100 ng) sono stati prelevati per l'amplificazione utilizzando i primer LdI descritti sopra. La miscela di reazione (50 µl) conteneva 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, una concentrazione di 200 µM di ciascun deossinucleosido trifosfato, 50 ng di ciascun primer e 1,25 U di Taq DNA polimerasi (Gibco BRL ). Ciascuna miscela di reazione è stata ricoperta con olio minerale e l'amplificazione è stata eseguita in un termociclatore (Perkin-Elmer, Warrington, Gran Bretagna) programmato per 40 cicli di denaturazione a 94°C per 1 min, ricottura a 45°C per 1 min, ed estensione a 72°C per 2 min, preceduta da una denaturazione iniziale di 2 min a 94°C. L'estensione finale è stata di 3 minuti a 72°C. I prodotti sono stati analizzati mediante elettroforesi in gel di agarosio all'1% contenente bromuro di etidio (0,5 µg/ml) in tampone TAE (0,04 M Tris acetato, 0,001 M EDTA) e fotografati sotto illuminazione UV.

Mini-exon PCR-RFLP: Il mini-exon PCR-RFLP è stato sviluppato dallo Swiss Tropical Institute (STI) (Marfurth et al. 2003).

Calcolo della dimensione del campione e variabili di risultato:

La dimensione del campione di 200 casi e 100 controlli si basa su considerazioni pratiche per soddisfare l'obiettivo primario dello sviluppo delle capacità e lo studio non è formalmente alimentato per la verifica delle ipotesi. L'enfasi per indagare la sensibilità e la specificità dei nuovi test diagnostici sarà sulla presentazione di statistiche descrittive e intervalli di confidenza.

Analisi dei dati:

La sensibilità (proporzione di risultati veri positivi correttamente identificati) e la specificità (proporzione di risultati veri negativi correttamente identificati) sono state calcolate per ciascun test diagnostico e gli intervalli di confidenza al 95% per queste proporzioni sono stati calcolati utilizzando il metodo Wilsons.

Anche i valori predittivi positivi e negativi sono stati calcolati utilizzando il metodo descritto da Altman et al. Il valore predittivo positivo è la proporzione di pazienti risultati positivi al test diagnostico sperimentale correttamente diagnosticati dall'esame parassitologico. Allo stesso modo il valore predittivo negativo è la proporzione di pazienti con risultato negativo del test diagnostico che sono correttamente diagnosticati dall'esame parassitologico. L'IC del 95% per i valori predittivi positivi e negativi era stato determinato. Questi parametri permetterebbero il confronto di ogni test diagnostico con l'esame parassitologico 'gold standard'.