En pilotundersøgelse til kapacitetsopbygning til et randomiseret multicenterforsøg til behandling af Kala Azar i Bangladesh

Specifikke mål:

Primært mål: At udvikle kapacitet til at evaluere nyere regimer til behandling af kala azar i Bangladesh.

Sekundære mål:

1. At evaluere nye diagnostiske test for kala azar inklusive rK39 dipstick test i serum; KATEX i urin; og PCR (polymerasekædereaktion) i blod og kliniske prøver.
2. At evaluere respons på behandling med 28 injektioner af SAG ved hjælp af PCR i blodprøver og kliniske prøver.
3. At overføre mini-exon PCR-RFLP teknikken til ICDDR,B og at karakterisere de mest udbredte Leishmania arter i området Mymensingh og deres respons på standardbehandling med SAG.
4. Vi vil også analysere, om visse genotyper er forbundet med forekomsten af ​​PKDL, og om mini-exon PCR er en egnet markør til at overvåge den intra- og interspecies genetiske udvikling af Leishmania-arter.

Forskningsdesign og metoder:

Patienterne til den foreslåede undersøgelse blev udvalgt fra tre upazilla-sundhedskomplekser i Mymensingh pr. diskussion med de offentlige myndigheder, der arbejder i disse områder. Hvis det er nødvendigt, vil vi gå til aktiv overvågning for at tilmelde det nødvendige antal forsøgspersoner til undersøgelsen.

Patienter

I alt blev 200 på hinanden følgende tilfælde (alder >5 år), der opfylder følgende diagnostiske kriterier for KA, inkluderet i undersøgelsen: (i) feber i >2 uger; (ii) mindst et af følgende kriterier: splenomegali, mørkfarvning af huden og vægttab; og (iii) en positiv rK39 oliepindstest. Eksklusionskriterier vil omfatte: (1) børn under fem år, (2) gravide kvinder og (3) patienter, der samtidig lider af enhver anden alvorlig sygdom, som ikke er relateret til kala azar. Patienter (eller deres forældre/værger i tilfælde af mindreårige), der opfylder ovenstående kriterier, blev forklaret om risikoen ved behandling med SAG og risikoen forbundet med miltaspirationsprocedurer af sagkyndige læger. Informeret samtykke (mundtligt eller skriftligt) blev derefter indhentet fra patienterne (eller deres forældre/værger i tilfælde af mindreårige) før optagelse i undersøgelsen. Et hundrede raske individer, der bor i samme område, blev tilmeldt som kontroller til evaluering af PCR og andre diagnostiske test af KA. Vores feltarbejdere besøgte huse i lokalsamfundet og indsamler blodprøver fra de raske frivillige med deres informerede samtykke.

Studieprocedurer og vurderinger

Milt aspiration:

Miltaspiration blev udført hos 200 på hinanden følgende patienter, som var blevet præsenteret for kliniske træk ved KA med en positiv rK39 dipstick-test. Miltaspiration blev udført til bekræftelse af diagnosen på undersøgelsesdag 1 og derefter igen på dag 29 for at vurdere helbredelse fra sygdommen. Når et forsøgsperson blev fundet positivt ved rK39-dipstick-test, blev standardtests før proceduren for miltaspiration, f.eks. hæmoglobin-estimering, blødningstid, koagulationstid og blodpladetal blev udført. Miltaspiration blev kun udført hos dem, der ikke var alvorligt anæmiske (Hb ≥ 6 mg/dl) og havde blodpladetal på >50.000/mikro liter blod. Protrombintiden blev også kontrolleret før miltaspiration, og dem med en PT mere end 4 sekunder forlænget var ikke kvalificerede til undersøgelsen. Al nødvendig behandling blev ydet i tilfælde af blødning efter proceduren, herunder blodtransfusion. Om nødvendigt transporteres patienterne også til Mymensingh Medical College Hospital, for mere specialiseret behandling og støtte.

Behandling og opfølgning

I Bangladesh er intramuskulær administration af natriumantimongluconat (SAG; Albert David Ltd., Indien), i en dosis på 20 mg/kg legemsvægt, med en maksimal dosis på 850 mg/dag, i otteogtyve dage den nuværende standardbehandling for patienter med KA. Puls og respirationsfrekvenser, blodtryk og temperatur blev overvåget med 12 timers intervaller i denne behandlingsperiode. EKG blev udført, hvis det var klinisk indiceret. Behandlingen blev stoppet, hvis der udvikledes tegn på alvorlig toksicitet (kardiotoksicitet, nyresvigt osv.), og patienten var blevet behandlet med standarddosis af amphotericin B.

Hospitalsindlæggelse: Alle patienter under behandling blev tilbudt at blive på Community-based Medical College Hospital i hele behandlingsperioden med SAG. Patienterne var blevet indlagt til behandling med amphotericin B i tilfælde af behandlingssvigt eller toksicitet med SAG.

Opfølgning: Ved afslutningen af ​​behandlingen blev patienterne vurderet for helbredelse ved fysisk undersøgelse og miltaspiration. Forsøgspersonerne havde fulgt i seks måneder som vist i Skema-2.

Diagnostiske test skal evalueres

rK39 målepindstest En blodprøve med fingerprikker blev opsamlet i kapillarrør til rK39 målepindstest. Denne metode er hurtig og tidsbesparende.

Parasitologisk diagnose

Miltaspirat blev brugt til parasitologisk diagnose. Et objektglas af miltaspirater blev forberedt til Giemsa-farvning. To laboratorieteknikere fra ICDDR,B blev trænet i farvningsteknikker og læsning af slides. Tilfældigt udvalgte slides var blevet sendt til referencelaboratorier andre steder til kvalitetskontrol.

Polymerasekædereaktion (PCR)

DNA fra Leishmania donovani i de indsamlede blodprøver var blevet påvist ved hjælp af metoderne beskrevet af Salotra et al.

Prøveindsamling og DNA-isolering: Udtaget blodprøve blev transporteret til Parasitology Laboratory of ICDDR,B og overført til 4°C og behandlet generelt samme dag. DNA blev ekstraheret fra 0,2 ml blod under anvendelse af et QIAamp DNA-blodminikit (Qiagen).

PCR-amplifikation: DNA fra dyrkede parasitter (1 ng) og fra kliniske prøver (100 ng) blev taget til amplifikation ved anvendelse af LdI-primerne beskrevet ovenfor. Reaktionsblandingen (50 µl) indeholdt 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, en koncentration på 200 µM af hvert deoxynukleosidtriphosphat, 50 ng af hver primer og 1,25 U Taq-DNA-polymerase (Gib-DNA-polymerase) ). Hver reaktionsblanding blev overlejret med mineralolie, og amplifikation blev udført i en termisk cycler (Perkin-Elmer, Warrington, Storbritannien) programmeret til 40 cyklusser af denaturering ved 94°C i 1 minut, annealing ved 45°C i 1 min. og forlængelse ved 72°C i 2 minutter, efterfulgt af en indledende denaturering på 2 minutter ved 94°C. Den endelige forlængelse var i 3 minutter ved 72°C. Produkter blev analyseret ved elektroforese i 1 % agarosegel indeholdende ethidiumbromid (0,5 µg/ml) i TAE-buffer (0,04 M Tris-acetat, 0,001 M EDTA) og fotograferet under UV-belysning.

Mini-exon PCR-RFLP: Mini-exon PCR-RFLP var blevet udviklet af Swiss Tropical Institute (STI) (Marfurth et al. 2003).

Prøvestørrelsesberegning og udfaldsvariable(r):

Stikprøvestørrelsen på 200 tilfælde og 100 kontroller er baseret på praktiske overvejelser for at opfylde det primære mål om kapacitetsudvikling, og undersøgelsen er ikke formelt drevet til hypotesetestning. Vægten for at undersøge sensitivitet og specificitet af de nye diagnostiske tests vil være på at præsentere beskrivende statistikker og konfidensintervaller.

Dataanalyse:

Sensitiviteten (andelen af ​​korrekt identificerede sande positive resultater) og specificiteten (andelen af ​​korrekt identificerede sande negative resultater) blev beregnet for hver diagnostisk test, og 95 % konfidensintervaller for disse andele var blevet beregnet ved hjælp af Wilsons metode.

De positive og negative prædiktive værdier blev også beregnet ved hjælp af metoden beskrevet af Altman et al. Den positive prædiktive værdi er andelen af ​​patienter med et positivt resultat for den eksperimentelle diagnostiske test, som er korrekt diagnosticeret ved parasitologisk undersøgelse. Tilsvarende er den negative prædiktive værdi andelen af ​​patienter med et negativt diagnostisk testresultat, som er korrekt diagnosticeret ved parasitologisk undersøgelse. 95 % CI for de positive og de negative prædiktive værdier var blevet bestemt. Disse parametre ville gøre det muligt at sammenligne hver diagnostisk test med den "guldstandard" parasitologiske undersøgelse.