自閉症スペクトラム障害の小児におけるエクソソームマイクロRNAの発現

この研究では、特発性 ASD (DSM-IV 基準で定義) を持つ 20 人の子供と、典型的な神経心理学的発達パターンを持つ年齢と性別が一致した対照 20 人を募集します。 この研究に必要な被験者の数は検出力分析によって決定されました。 各グループに 15 人の ASD 被験者と 15 人の対照被験者を含む 2 サンプルの t 検定モデルを使用すると、ボンフェローニ補正レベルによるグループ平均の標準偏差の 2 倍に等しい発現変化を検出する検出力が 80% になります (p<0.0001)。 各サンプルで 500 個の miRNA を測定するという予想に基づいています (Lenth、2006)。

親の同意書と患者の同意書は、大学小児科青少年センターと発達行動遺伝学センターで対象となる可能性のある人に配布されます。 研究について説明するために、子供たちには「医師たちは自閉症という病気についての研究を行っています。 この研究に参加したい場合は、腕から針で少量の血液が採取されます。 針は痛いですが、しばらくすると痛みはなくなります。 医師はあなたの気持ちについていくつかの質問に答えるように求めます。 研究室にいる必要はありません。 あなたがこれをしたくないとしても、誰もあなたを怒ることはありません。」

ASD被験者は、自閉症診断における現在の方法である自閉症診断観察スケジュール（ADOS）と幼児自閉症チェックリスト（CHAT）を使用して評価されます。 Vineland Behavior Scale も管理されます。 収集されたすべての医療情報は、標準プロトコルに従ってコード化され、匿名化されます。

静脈穿刺を使用して、各被験者からEDTAを含まないバキュテナーチューブに2mlの血液を採取します。 サンプルを 37 ℃で 1 時間放置して凝固させた後、4 ℃で一晩保存します。 次に、サンプルを 4℃、4000 rpm で 20 分間遠心分離します。 血清はピペッティングによって血塊から除去され、miRNA 抽出が実行されるまで -80°C で保存されます。

血清からエクソソーム miRNA を測定するという決定は、12 人の体液中の miRNA の研究によって裏付けられています。 Weber ら (2010) は、血漿中の RNA の総濃度中央値 (308 ug/L) が脳脊髄液の総濃度 (111 ug/L) よりも高いと測定しました。 さらに、著者らは、血漿中の検出可能な miRNA の数 (349) が脳脊髄液 (212) よりも多いことを発見しました。 血漿と脳脊髄液の miRNA 含有量には、いくつかの興味深い類似点があります。 脳脊髄液および血漿中に最も豊富に存在する 20 個の miRNA のうち、9 個が重複しています。 我々は以前、ヒトのアルコール依存症患者の血清におけるエキソソーム miRNA の発現を調べました。 興味深いことに、我々は、検査対象の 30% 以上の血清サンプルにおける脳特異的 miRNA の発現レベルを特徴付けました。 この発見は、中枢神経系由来のエキソソーム miRNA がヒトの血液サンプル中で検出および定量できることを示しています。

血清 miRNA は、Qiagen RNeasy Mini Kit を使用して、製造元のプロトコールに従って抽出されます。 RNA は Genisphere FlashTag HSR RNA 標識キットで処理されます。 RNA スパイク コントロール オリゴとポリ (A) テールが各 RNA サンプルに追加され、ビオチン化シグナル伝達分子が RNA に連結されます。 標識された RNA サンプルはハイブリダイゼーション カクテルに追加され、インキュベートされて、Affymetrix miRNA 2.0 アレイに注入されます。 16 時間のハイブリダイゼーション後、プロトコル FS450_0003 を使用して、Affymetrix 流体ステーション 450 でアレイを洗浄し、染色します。 アレイは、Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus でスキャンされます。 cel ファイルは、miRNA QC Tool バージョン 1.1.1.0 を使用して分析されます。

ASD、年齢、性別が miRNA 発現に及ぼす影響を評価する 3 元配置分散分析は、マン ホイットニー テストとともに使用されます。 P 値 < 0.05 のターゲットは、ボンフェローニ分析による複数のテスト補正の後、さらなる分析のために選択されます。 大幅に変更された miRNA は、既知の mRNA ターゲットについて Mirbase.org でクエリされます。 次に、ターゲット リストは、強化された遺伝子オントロジー カテゴリの DAVID バイオインフォマティクス機能アノテーション ツールを使用して検査されます。 miRNA 発現と医学的/神経心理学的特性の間の相関関係は、p 値 <0.05 で miRNA をフィルタリングするピアソン相関統計を使用して計算されます。 そしてr>0.5。