Expression de microARN exosomal chez les enfants atteints de troubles du spectre autistique

Cette étude recrutera 20 enfants atteints de TSA idiopathique (définis par les critères du DSM-IV) et 20 témoins appariés selon l'âge et le sexe avec des schémas de développement neuropsychologiques typiques. Le nombre de sujets nécessaires pour cette étude a été déterminé par analyse de puissance. L'utilisation d'un modèle de test t à deux échantillons avec 15 sujets TSA et 15 sujets témoins dans chaque groupe aurait une puissance de 80 % pour détecter des changements d'expression égaux à deux fois l'écart type de la moyenne du groupe avec le niveau corrigé de Bonferonni (p <0,0001) basé sur les attentes de mesurer 500 miARN dans chaque échantillon (Lenth, 2006).

Des formulaires de consentement parental et d'assentiment du patient seront distribués aux sujets potentiels au Centre universitaire de pédiatrie et d'adolescence et au Centre de comportement et de génétique du développement. Pour expliquer l'étude, on dira aux enfants : "Les médecins font une étude sur une maladie appelée autisme. Si vous souhaitez participer à cette étude, une petite quantité de sang sera prélevée de votre bras avec une aiguille. L'aiguille fera mal mais disparaîtra après un petit moment. Les médecins vous demanderont de répondre à quelques questions sur la façon dont vous vous sentez. Vous n'êtes pas obligé d'être dans l'étude. Personne ne sera en colère contre toi si tu ne veux pas faire ça."

Les sujets TSA seront évalués à l'aide des méthodes actuelles de diagnostic de l'autisme : l'Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS) et la Checklist for Autism in Toddlers (CHAT). Les échelles de comportement de Vineland seront également administrées. Toutes les informations médicales collectées seront codées et anonymisées conformément aux protocoles standard.

La ponction veineuse sera utilisée pour recueillir 2 ml de sang de chaque sujet dans un tube Vacutainer sans EDTA. Les échantillons seront laissés pendant 1 heure à 37 °C pour permettre la coagulation avant stockage à 4 °C pendant la nuit. L'échantillon sera ensuite centrifugé à 4000 rpm pendant 20 minutes à 4˚C. Le sérum sera retiré du caillot par pipetage et stocké à -80 °C jusqu'à ce que l'extraction des miARN soit effectuée.

La décision de mesurer le miARN exosomal du sérum est étayée par une étude du miARN dans 12 fluides corporels humains. Weber et ses collègues (2010) ont déterminé que la concentration totale médiane d'ARN dans le plasma (308 ug/L) était supérieure à celle du liquide céphalo-rachidien (111 ug/L). De plus, les auteurs ont trouvé que le nombre de miARN détectables dans le plasma (349) était supérieur à celui du liquide céphalo-rachidien (212). La teneur en miARN du plasma et du liquide céphalo-rachidien présente des similitudes intrigantes. Sur les vingt miARN les plus abondants trouvés dans le liquide céphalo-rachidien et le plasma, 9 se chevauchent. Nous avons précédemment examiné l'expression de miARN exosomal dans le sérum de sujets humains alcooliques. Curieusement, nous avons caractérisé les niveaux d'expression des miARN spécifiques au cerveau dans des échantillons de sérum de plus de 30 % des personnes testées. Cette découverte démontre que les miARN exosomal du système nerveux central peuvent être détectés et quantifiés dans des échantillons de sang humain.

Les miARN sériques seront extraits à l'aide d'un kit Qiagen RNeasy Mini selon le protocole du fabricant. L'ARN sera traité avec le kit de marquage d'ARN Genisphere FlashTag HSR. Des oligos de contrôle de pointe d'ARN et des queues poly (A) seront ajoutés à chaque échantillon d'ARN et une molécule de signalisation biotinylée sera ligaturée à l'ARN. Les échantillons d'ARN marqués seront ajoutés à un cocktail d'hybridation, incubés et injectés dans des puces Affymetrix miRNA 2.0. Après 16 heures d'hybridation, les puces seront lavées et colorées sur une station fluidique Affymetrix 450 en utilisant le protocole FS450_0003. Les puces seront scannées sur un Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus. Les fichiers cel seront analysés à l'aide de miRNA QC Tool version 1.1.1.0.

Une ANOVA à 3 voies évaluant l'impact du TSA, de l'âge et du sexe sur l'expression des miARN sera utilisée avec un test de Mann Whitney. Les cibles avec une valeur P <0,05 seront sélectionnées pour une analyse plus approfondie après plusieurs tests de correction avec l'analyse de Bonferroni. Les miARN significativement modifiés seront interrogés sur Mirbase.org pour les cibles d'ARNm connues. La liste cible sera ensuite examinée à l'aide de l'outil d'annotation fonctionnelle bioinformatique DAVID pour les catégories d'ontologies génétiques enrichies. Les corrélations entre l'expression des miARN et les caractéristiques médicales/neuropsychologiques seront calculées à l'aide des statistiques de corrélation de Pearson, en filtrant les miARN avec une valeur p <0,05 et r>0,5.