Expresión de microARN exosomal en niños con trastorno del espectro autista

Este estudio reclutará a 20 niños con TEA idiopático (definido por los criterios del DSM-IV) y 20 controles emparejados por edad y género con patrones típicos de desarrollo neuropsicológico. El número de sujetos necesarios para este estudio se determinó mediante análisis de potencia. El uso de un modelo de prueba t de dos muestras con 15 ASD y 15 sujetos de control en cada grupo tendría una potencia del 80 % para detectar cambios en la expresión equivalentes al doble de la desviación estándar de la media del grupo con el nivel corregido de Bonferonni (p<0,0001) basado en expectativas de medir 500 miRNA en cada muestra (Lenth, 2006).

Los formularios de consentimiento de los padres y de asentimiento del paciente se distribuirán a los sujetos potenciales en el Centro Universitario de Pediatría y Adolescentes y el Centro para el Desarrollo del Comportamiento y la Genética. Para explicar el estudio, se les dirá a los niños: "Los médicos están realizando un estudio sobre una enfermedad llamada autismo. Si desea participar en este estudio, se le extraerá una pequeña cantidad de sangre de su brazo con una aguja. La aguja dolerá pero desaparecerá después de un tiempo. Los médicos le pedirán que responda algunas preguntas sobre cómo se siente. Usted no tiene que estar en el estudio. Nadie se enfadará contigo si no quieres hacer esto".

Los sujetos con TEA serán evaluados utilizando los métodos actuales en el diagnóstico del autismo: el Programa de Observación de Diagnóstico del Autismo (ADOS) y la Lista de Verificación para el Autismo en Niños Pequeños (CHAT). También se administrarán las escalas de comportamiento de Vineland. Toda la información médica recopilada se codificará y desidentificará de acuerdo con los protocolos estándar.

Se empleará la venopunción para recolectar 2 ml de sangre de cada sujeto en un tubo vacutainer sin EDTA. Las muestras se dejarán durante 1 hora a 37 ˚C para permitir la coagulación antes de almacenarlas a 4 ˚C durante la noche. A continuación, la muestra se centrifugará a 4000 rpm durante 20 minutos a 4˚C. El suero se eliminará del coágulo mediante pipeteo y se almacenará a -80 °C hasta que se realice la extracción de miARN.

La decisión de medir el miARN exosomal del suero está respaldada por un estudio de miARN en 12 fluidos corporales humanos. Weber y colaboradores (2010) determinaron que la mediana de la concentración total de ARN en plasma (308 ug/L) era mayor que la del líquido cefalorraquídeo (111 ug/L). Además, los autores encontraron que la cantidad de miARN detectables en plasma (349) era mayor que en el líquido cefalorraquídeo (212). El contenido de miARN del plasma y el líquido cefalorraquídeo tiene algunas similitudes intrigantes. De los veinte miARN más abundantes que se encuentran en el líquido cefalorraquídeo y el plasma, 9 se superponen. Hemos examinado previamente la expresión de miARN exosómico en el suero de sujetos alcohólicos humanos. Curiosamente, caracterizamos los niveles de expresión de miARN específicos del cerebro en muestras de suero de más del 30 % de las analizadas. Este hallazgo demuestra que los miARN exosómicos del sistema nervioso central pueden detectarse y cuantificarse en muestras de sangre humana.

El miARN sérico se extraerá con un minikit Qiagen RNeasy según el protocolo del fabricante. El ARN se procesará con el kit de etiquetado Genisphere FlashTag HSR RNA. Se agregarán oligos de control de picos de ARN y colas de poli(A) a cada muestra de ARN y se ligará una molécula de señalización biotinilada al ARN. Las muestras de ARN marcadas se agregarán a un cóctel de hibridación, se incubarán y se inyectarán en matrices Affymetrix miRNA 2.0. Después de 16 horas de hibridación, las matrices se lavarán y teñirán en una estación de fluídica Affymetrix 450 utilizando el protocolo FS450_0003. Las matrices se escanearán en un Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus. Los archivos cel se analizarán con miRNA QC Tool versión 1.1.1.0.

Se empleará un ANOVA de 3 vías que evalúa el impacto del TEA, la edad y el género en la expresión de miARN junto con una prueba de Mann Whitney. Los objetivos con un valor P < 0,05 se seleccionarán para un análisis posterior después de la corrección de múltiples pruebas con el análisis de Bonferroni. Los miARN significativamente alterados se consultarán en Mirbase.org en busca de objetivos de ARNm conocidos. Luego, la lista de objetivos se examinará utilizando la herramienta de anotación funcional de bioinformática DAVID para categorías de ontología de genes enriquecidos. Las correlaciones entre la expresión de miARN y las características médicas/neuropsicológicas se calcularán utilizando las estadísticas de correlación de Pearson, filtrando miARN con valor p<0,05 yr>0,5.