Eksosomaalinen mikroRNA:n ilmentyminen lapsilla, joilla on autismispektrihäiriö

Tähän tutkimukseen otetaan mukaan 20 lasta, joilla on idiopaattinen ASD (määritelty DSM-IV-kriteereillä) ja 20 iän ja sukupuolen mukaan yhteensopivaa kontrollia, joilla on tyypillisiä neuropsykologisia kehitysmalleja. Tähän tutkimukseen tarvittavien koehenkilöiden lukumäärä määritettiin tehoanalyysillä. Käytettäessä kahden näytteen t-testimallia, jossa on 15 ASD:tä ja 15 kontrollikohdetta kussakin ryhmässä, olisi 80 %:n kyky havaita muutokset ekspressiossa, joka on kaksinkertainen ryhmän keskiarvon standardipoikkeamaan Bonferonni-korjatulla tasolla (p<0,0001). perustuu odotuksiin, että kussakin näytteessä mitataan 500 miRNA:ta (Lenth, 2006).

Vanhempien suostumus- ja potilaan suostumuslomakkeet jaetaan mahdollisille tutkittaville yliopiston Lasten- ja nuorisokeskuksessa sekä Kehityskäyttäytymisen ja genetiikan keskuksessa. Tutkimuksen selittämiseksi lapsille kerrotaan: "Lääkärit tekevät tutkimusta sairaudesta, jota kutsutaan autismiksi. Jos haluat olla mukana tässä tutkimuksessa, käsivarresta otetaan neulalla pieni määrä verta. Neula sattuu, mutta häviää hetken kuluttua. Lääkärit pyytävät sinua vastaamaan joihinkin kysymyksiin miltä sinusta tuntuu. Sinun ei tarvitse olla tutkimuksessa. Kukaan ei ole sinulle vihainen, jos et halua tehdä tätä."

ASD-kohteita arvioidaan nykyisillä autismin diagnoosin menetelmillä: Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS) ja Checklist for Autism in Toddlers (CHAT). Myös Vineland Behavior Scales -asteikkoja hallinnoidaan. Kaikki kerätyt lääketieteelliset tiedot koodataan ja niiden tunniste poistetaan standardiprotokollien mukaisesti.

Suonenpunktiota käytetään 2 ml:n verta keräämiseksi jokaiselta kohteelta EDTA-vapaaseen vacutainer-putkeen. Näytteet jätetään 1 tunniksi 37 ˚C:seen hyytymisen mahdollistamiseksi ennen säilytystä 4 ˚C:ssa yön yli. Näytettä sentrifugoidaan sitten nopeudella 4000 rpm 20 minuuttia 4 °C:ssa. Seerumi poistetaan hyytymisestä pipetoimalla ja säilytetään -80 ˚C:ssa, kunnes miRNA-uutto suoritetaan.

Päätöstä mitata eksosomaalista miRNA:ta seerumista tukee miRNA-tutkimus 12 ihmiskehon nesteessä. Weber ja kollegat (2010) määrittelivät, että RNA:n kokonaispitoisuuden mediaani plasmassa (308 ug/l) oli suurempi kuin aivo-selkäydinnesteen (111 ug/l). Lisäksi kirjoittajat havaitsivat havaittavien miRNA:iden määrän plasmassa (349) olevan suurempi kuin aivo-selkäydinnesteessä (212). Plasman ja aivo-selkäydinnesteen miRNA-sisällöllä on joitain kiehtovia yhtäläisyyksiä. Kahdestakymmenestä runsaimmasta aivo-selkäydinnesteestä ja plasmasta löytyvästä miRNA:sta 9 on päällekkäistä. Olemme aiemmin tutkineet eksosomaalisen miRNA:n ilmentymistä alkoholistien ihmisten seerumissa. Kiinnostavasti karakterisoimme aivospesifisten miRNA:iden ilmentymistasoja seeruminäytteissä yli 30 % testatuista. Tämä havainto osoittaa, että keskushermoston eksosomaaliset miRNA:t voidaan havaita ja kvantifioida ihmisen verinäytteistä.

Seerumin miRNA uutetaan käyttämällä Qiagen RNeasy Mini Kit -sarjaa valmistajan protokollan mukaisesti. RNA käsitellään Genisphere FlashTag HSR RNA -leimaussarjalla. RNA Spike Control -oligoja ja poly(A)-pyrstöjä lisätään jokaiseen RNA-näytteeseen ja biotinyloitu signalointimolekyyli liitetään RNA:han. Leimatut RNA-näytteet lisätään hybridisaatiococktailuun, inkuboidaan ja injektoidaan Affymetrix miRNA 2.0 -siruihin. 16 tunnin hybridisaation jälkeen rivit pestään ja värjätään Affymetrix-fluidiikkaasemalla 450 käyttämällä protokollaa FS450_0003. Taulukot skannataan Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus -laitteella. Cel-tiedostot analysoidaan käyttämällä miRNA QC Tool versiota 1.1.1.0.

Mann Whitney -testin ohella käytetään kolmisuuntaista ANOVAa, jossa arvioidaan ASD:n, iän ja sukupuolen vaikutusta miRNA-ilmentymiseen. Kohteet, joiden P-arvo on < 0,05, valitaan lisäanalyyseihin usean testauksen jälkeen Bonferroni-analyysillä. Merkittävästi muuttuneista miRNA:ista kysytään Mirbase.orgissa tunnettuja mRNA-kohteita. Kohdeluetteloa tarkastellaan sitten käyttämällä DAVID-bioinformatiikan toiminnallista annotaatiotyökalua rikastetuille geeniontologiakategorioille. Korrelaatiot miRNA:n ilmentymisen ja lääketieteellisten/neuropsykologisten ominaisuuksien välillä lasketaan käyttämällä Pearson Correlation -tilastoja, suodattamalla miRNA:t, joiden p-arvo on < 0,05 ja r>0,5.