Exosomální mikroRNA exprese u dětí s poruchou autistického spektra

Tato studie zahrne 20 dětí s idiopatickou ASD (definovanou kritérii DSM-IV) a 20 věkově a genderově odpovídajících kontrol s typickými neuropsychologickými vývojovými vzory. Počet subjektů nezbytný pro tuto studii byl stanoven pomocí analýzy síly. Použití dvouvzorkového modelu t-testu s 15 ASD a 15 kontrolními subjekty v každé skupině by mělo 80% schopnost detekovat změny v expresi rovnající se dvojnásobku standardní odchylky od průměru skupiny s Bonferonniho korigovanou hladinou (p<0,0001) na základě očekávání měření 500 miRNA v každém vzorku (Lenth, 2006).

Formuláře souhlasu rodičů a souhlasu pacienta budou distribuovány potenciálním subjektům Univerzitního pediatrického a dorostového centra a Centra pro rozvojové chování a genetiku. Pro vysvětlení studie bude dětem řečeno: „Lékaři provádějí studii o nemoci zvané autismus. Pokud chcete být v této studii, bude vám jehlou odebráno malé množství krve z paže. Jehla bude bolet, ale po chvíli zmizí. Lékaři vás požádají, abyste odpověděli na některé otázky o tom, jak se cítíte. Nemusíte být ve studovně. Nikdo se na tebe nebude zlobit, když to nebudeš chtít udělat."

Subjekty s PAS budou hodnoceny pomocí současných metod v diagnostice autismu: Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS) a Checklist for Autism in Toddlers (CHAT). Bude také spravována Vinelandova škála chování. Všechny shromážděné lékařské informace budou zakódovány a deidentifikovány podle standardních protokolů.

Venipunkce se použije k odběru 2 ml krve od každého subjektu do zkumavky Vacutainer bez EDTA. Vzorky budou ponechány 1 hodinu při 37 °C, aby se umožnily srážení před skladováním při 4 °C přes noc. Vzorek bude poté centrifugován při 4000 otáčkách za minutu po dobu 20 minut při 4˚C. Sérum bude odebráno ze sraženiny pipetováním a skladováno při -80˚C, dokud nebude provedena extrakce miRNA.

Rozhodnutí měřit exosomální miRNA ze séra je podpořeno studií miRNA ve 12 lidských tělesných tekutinách. Weber a kolegové (2010) určili, že střední celková koncentrace RNA v plazmě (308 ug/l) byla vyšší než v mozkomíšním moku (111 ug/l). Dále autoři zjistili, že počet detekovatelných miRNA v plazmě (349) je vyšší než v mozkomíšním moku (212). Obsah miRNA v plazmě a mozkomíšním moku má některé zajímavé podobnosti. Z dvaceti nejhojnějších miRNA nalezených v mozkomíšním moku a plazmě se 9 překrývá. Již dříve jsme zkoumali expresi exosomální miRNA v séru lidských alkoholických subjektů. Zajímavě jsme charakterizovali hladiny exprese mozkově specifických miRNA ve vzorcích séra od více než 30 % testovaných. Toto zjištění ukazuje, že exosomální miRNA z centrálního nervového systému lze detekovat a kvantifikovat ve vzorcích lidské krve.

Sérová miRNA bude extrahována pomocí sady Qiagen RNeasy Mini Kit podle protokolu výrobce. RNA bude zpracována soupravou Genisphere FlashTag HSR pro značení RNA. Ke každému vzorku RNA se přidají RNA Spike Control Oligo a poly(A) konce a biotinylovaná signální molekula se liguje do RNA. Značené vzorky RNA budou přidány do hybridizačního koktejlu, inkubovány a injikovány do čipů Affymetrix miRNA 2.0. Po 16 hodinách hybridizace se čipy promyjí a barví na Affymetrix fluidics station 450 s použitím protokolu FS450_0003. Pole budou skenována na Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus. Soubory cel budou analyzovány pomocí nástroje miRNA QC Tool verze 1.1.1.0.

3-cestná ANOVA hodnotící dopad ASD, věku a pohlaví na expresi miRNA bude použita spolu s Mann Whitney testem. Cíle s P-hodnotou < 0,05 budou vybrány pro další analýzu po několikanásobné korekci testování pomocí Bonferroniho analýzy. Významně změněné miRNA budou na Mirbase.org dotazovány na známé cíle mRNA. Cílový seznam bude poté zkoumán pomocí funkčního anotačního nástroje DAVID bioinformatiky pro obohacené kategorie genové ontologie. Korelace mezi expresí miRNA a lékařskými/neuropsychologickými charakteristikami budou vypočítány pomocí Pearsonovy korelační statistiky, filtrování pro miRNA s p-hodnotou <0,05 a r > 0,5.