Egzosomalna ekspresja mikroRNA u dzieci z zaburzeniami ze spektrum autyzmu

Do tego badania zostanie włączonych 20 dzieci z idiopatycznym ASD (zdefiniowanym według kryteriów DSM-IV) oraz 20 osób z grupy kontrolnej dobranej pod względem wieku i płci, z typowymi neuropsychologicznymi wzorcami rozwojowymi. Liczbę osób potrzebnych do tego badania określono za pomocą analizy mocy. Użycie modelu testu t z dwiema próbami z 15 osobami z autyzmem i 15 kontrolnymi w każdej grupie miałoby 80% mocy do wykrycia zmian w ekspresji równych dwukrotności odchylenia standardowego średniej grupy z poziomem skorygowanym Bonferonniego (p<0,0001) w oparciu o oczekiwania pomiaru 500 miRNA w każdej próbce (Lenth, 2006).

Zgoda rodziców i formularze zgody pacjentów zostaną rozesłane do potencjalnych pacjentów w Uniwersyteckim Centrum Pediatrii i Młodzieży oraz w Centrum Rozwoju Zachowań i Genetyki. Aby wyjaśnić badanie, dzieciom powiedziano: „Lekarze prowadzą badanie dotyczące choroby zwanej autyzmem. Jeśli chcesz wziąć udział w tym badaniu, niewielka ilość krwi zostanie pobrana z ramienia za pomocą igły. Igła będzie bolała, ale po chwili zniknie. Lekarze poproszą Cię o odpowiedź na kilka pytań dotyczących Twojego samopoczucia. Nie musisz być na studiach. Nikt nie będzie na ciebie zły, jeśli nie będziesz tego chciał”.

Osoby z ASD będą oceniane przy użyciu aktualnych metod diagnozy autyzmu: Harmonogramu Obserwacji Diagnostyki Autyzmu (ADOS) oraz Listy Kontrolnej dla Autyzmu u Małych Dzieci (CHAT). Zostaną również zastosowane Skale Zachowania Vineland. Wszystkie zebrane informacje medyczne zostaną zakodowane i pozbawione elementów umożliwiających identyfikację zgodnie ze standardowymi protokołami.

W celu pobrania 2 ml krwi od każdego pacjenta do probówki Vacutainer niezawierającej EDTA zostanie zastosowane nakłucie żyły. Próbki zostaną pozostawione na 1 godzinę w temperaturze 37˚C, aby umożliwić skrzepnięcie przed przechowywaniem w temperaturze 4˚C przez noc. Próbka będzie następnie wirowana przy 4000 obr./min przez 20 minut w temperaturze 4˚C. Surowica zostanie usunięta ze skrzepu przez pipetowanie i będzie przechowywana w temperaturze -80˚C do czasu przeprowadzenia ekstrakcji miRNA.

Decyzja o pomiarze egzosomalnego miRNA z surowicy jest poparta badaniem miRNA w 12 płynach ustrojowych człowieka. Weber i współpracownicy (2010) ustalili, że mediana całkowitego stężenia RNA w osoczu (308 ug/l) była większa niż w płynie mózgowo-rdzeniowym (111 ug/l). Ponadto autorzy stwierdzili, że liczba wykrywalnych miRNA w osoczu (349) jest większa niż w płynie mózgowo-rdzeniowym (212). Zawartość miRNA w osoczu i płynie mózgowo-rdzeniowym ma pewne intrygujące podobieństwa. Spośród dwudziestu najbardziej rozpowszechnionych miRNA znalezionych w płynie mózgowo-rdzeniowym i osoczu, 9 pokrywa się. Wcześniej badaliśmy ekspresję egzosomalnego miRNA w surowicy ludzkich alkoholików. Co ciekawe, scharakteryzowaliśmy poziomy ekspresji specyficznych dla mózgu miRNA w próbkach surowicy od ponad 30% badanych. To odkrycie pokazuje, że egzosomalne miRNA z ośrodkowego układu nerwowego można wykrywać i oznaczać ilościowo w próbkach ludzkiej krwi.

Surowica miRNA zostanie wyekstrahowana przy użyciu zestawu Qiagen RNeasy Mini Kit zgodnie z protokołem producenta. RNA będzie przetwarzane za pomocą zestawu do znakowania Genisphere FlashTag HSR RNA. RNA Spike Control Oligo i ogony poli(A) zostaną dodane do każdej próbki RNA, a biotynylowana cząsteczka sygnałowa zostanie zligowana z RNA. Wyznakowane próbki RNA zostaną dodane do koktajlu hybrydyzacyjnego, inkubowane i wstrzyknięte do macierzy Affymetrix miRNA 2.0. Po 16 godzinach hybrydyzacji, macierze zostaną przemyte i wybarwione na stacji fluidycznej Affymetrix 450 przy użyciu protokołu FS450_0003. Macierze zostaną zeskanowane na skanerze Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus. Pliki cel zostaną przeanalizowane przy użyciu narzędzia miRNA QC Tool w wersji 1.1.1.0.

Zastosowana zostanie trójczynnikowa analiza ANOVA oceniająca wpływ ASD, wieku i płci na ekspresję miRNA wraz z testem Manna Whitneya. Cele o wartości P < 0,05 zostaną wybrane do dalszej analizy po wielokrotnej korekcie testowej za pomocą analizy Bonferroniego. Znacząco zmienione miRNA zostaną przeszukane na Mirbase.org pod kątem znanych celów mRNA. Lista docelowa zostanie następnie zbadana za pomocą funkcjonalnego narzędzia adnotacji bioinformatycznej DAVID dla wzbogaconych kategorii ontologii genów. Korelacje między ekspresją miRNA a cechami medycznymi/neuropsychologicznymi zostaną obliczone przy użyciu statystyki korelacji Pearsona, filtrując miRNA o wartości p <0,05 i r>0,5.