自闭症谱系障碍儿童的外泌体 MicroRNA 表达

本研究将招募 20 名患有特发性 ASD（根据 DSM-IV 标准定义）的儿童和 20 名具有典型神经心理发育模式的年龄和性别匹配的对照。 本研究所需的受试者数量由功效分析确定。 使用双样本 t 检验模型，每组有 15 个 ASD 和 15 个对照受试者，将有 80% 的能力检测表达变化等于组平均值标准偏差的两倍，并采用 Bonferonni 校正水平 (p<0.0001) 基于在每个样本中测量 500 个 miRNA 的预期 (Lenth, 2006)。

父母同意书和患者同意书将分发给大学儿科和青少年中心以及发展行为和遗传学中心的潜在受试者。 为了解释这项研究，孩子们会被告知，“医生们正在研究一种叫做自闭症的疾病。 如果您想参加这项研究，将用针头从您的手臂抽取少量血液。 针头会痛，但过一会儿就会消失。 医生会要求您回答一些关于您的感受的问题。 您不必在研究中。 如果你不想这样做，没有人会生你的气。”

ASD 受试者将使用目前的自闭症诊断方法进行评估：自闭症诊断观察表 (ADOS) 和幼儿自闭症检查表 (CHAT)。 还将管理 Vineland 行为量表。 所有收集到的医疗信息都将根据标准协议进行编码和去识别化。

将采用静脉穿刺术从每个受试者收集 2ml 血液到不含 EDTA 的真空采血管中。 样品将在 37˚C 下放置 1 小时以允许凝结，然后在 4˚C 下储存过夜。 然后将样品在 4˚C 下以 4000 rpm 离心 20 分钟。 血清将通过移液器从凝块中去除并储存在 -80˚C 下，直到进行 miRNA 提取。

对 12 种人体体液中 miRNA 的研究支持了从血清中测量外泌体 miRNA 的决定。 Weber 及其同事 (2010) 确定血浆中 RNA 的中位总浓度 (308 ug/L) 高于脑脊液 (111 ug/L)。 此外，作者发现血浆中可检测到的 miRNA 数量 (349) 多于脑脊液 (212)。 血浆和脑脊液的 miRNA 含量有一些有趣的相似之处。 在脑脊液和血浆中发现的 20 个最丰富的 miRNA 中，有 9 个重叠。 我们之前已经检查了人类酒精受试者血清中外泌体 miRNA 的表达。 有趣的是，我们对来自超过 30% 的测试对象的血清样本中大脑特异性 miRNA 的表达水平进行了表征。 这一发现表明，可以在人类血液样本中检测和量化来自中枢神经系统的外泌体 miRNA。

根据制造商的方案，将使用 Qiagen RNeasy Mini Kit 提取血清 miRNA。 RNA 将使用 Genisphere FlashTag HSR RNA 标记试剂盒进行处理。 RNA Spike Control Oligos 和 poly(A) 尾巴将被添加到每个 RNA 样品中，生物素化的信号分子将被连接到 RNA 上。 标记的 RNA 样品将被添加到杂交混合物中，孵育，然后注入 Affymetrix miRNA 2.0 阵列。 杂交 16 小时后，使用方案 FS450_0003 在 Affymetrix 射流站 450 上清洗和染色阵列。 阵列将在 Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus 上扫描。 将使用 miRNA QC 工具版本 1.1.1.0 分析 cel 文件。

评估 ASD、年龄​​和性别对 miRNA 表达的影响的三向方差分析将与 Mann Whitney 检验一起使用。 在使用 Bonferroni 分析进行多次测试校正后，将选择 P 值 < 0.05 的目标进行进一步分析。 显着改变的 miRNA 将在 Mirbase.org 上查询已知的 mRNA 目标。 然后将使用 DAVID 生物信息学功能注释工具检查目标列表以丰富基因本体类别。 将使用 Pearson 相关统计计算 miRNA 表达与医学/神经心理学特征之间的相关性，过滤 p 值<0.05 的 miRNA r>0.5。