Espressione di microRNA esosomiale nei bambini con disturbo dello spettro autistico

Questo studio recluterà 20 bambini con ASD idiopatico (definito dai criteri del DSM-IV) e 20 controlli abbinati per età e sesso con tipici modelli di sviluppo neuropsicologico. Il numero di soggetti necessari per questo studio è stato determinato mediante analisi di potenza. L'utilizzo di un modello di test t a due campioni con 15 soggetti ASD e 15 soggetti di controllo in ciascun gruppo avrebbe una potenza dell'80% per rilevare cambiamenti nell'espressione pari al doppio della deviazione standard della media del gruppo con livello corretto di Bonferonni (p <0,0001) sulla base delle aspettative di misurare 500 miRNA in ciascun campione (Lenth, 2006).

I moduli di consenso dei genitori e di assenso del paziente saranno distribuiti ai potenziali soggetti presso il Centro universitario di pediatria e adolescenza e il Centro per lo sviluppo del comportamento e la genetica. Per spiegare lo studio, ai bambini verrà detto: "I medici stanno facendo uno studio su una malattia chiamata autismo. Se vuoi partecipare a questo studio, ti verrà prelevata una piccola quantità di sangue dal braccio con un ago. L'ago farà male ma andrà via dopo un po'. I medici ti chiederanno di rispondere ad alcune domande su come ti senti. Non devi essere nello studio. Nessuno si arrabbierà con te se non vuoi farlo".

I soggetti ASD saranno valutati utilizzando i metodi attuali nella diagnosi dell'autismo: l'Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS) e la Checklist for Autism in Toddlers (CHAT). Verranno inoltre somministrate le Vineland Behavior Scales. Tutte le informazioni mediche raccolte saranno codificate e anonimizzate secondo protocolli standard.

Verrà impiegata la venipuntura per raccogliere 2 ml di sangue da ciascun soggetto in una provetta vacutainer priva di EDTA. I campioni verranno lasciati per 1 ora a 37˚C per consentire la coagulazione prima della conservazione a 4˚C durante la notte. Il campione verrà quindi centrifugato a 4000 rpm per 20 minuti a 4˚C. Il siero verrà rimosso dal coagulo pipettando e conservato a -80°C fino all'estrazione del miRNA.

La decisione di misurare il miRNA esosomiale dal siero è supportata da uno studio del miRNA in 12 fluidi corporei umani. Weber e colleghi (2010) hanno stabilito che la concentrazione totale mediana di RNA nel plasma (308 ug/L) era maggiore di quella del liquido cerebrospinale (111 ug/L). Inoltre, gli autori hanno riscontrato che il numero di miRNA rilevabili nel plasma (349) è maggiore del liquido cerebrospinale (212). Il contenuto di miRNA nel plasma e nel liquido cerebrospinale presenta alcune intriganti somiglianze. Dei venti miRNA più abbondanti trovati nel liquido cerebrospinale e nel plasma, 9 si sovrappongono. Abbiamo precedentemente esaminato l'espressione del miRNA esosomiale nel siero di soggetti alcolisti umani. Curiosamente, abbiamo caratterizzato i livelli di espressione dei miRNA specifici del cervello nei campioni di siero di oltre il 30% di quelli testati. Questa scoperta dimostra che i miRNA esosomiali del sistema nervoso centrale possono essere rilevati e quantificati in campioni di sangue umano.

Il miRNA sierico sarà estratto utilizzando un Qiagen RNeasy Mini Kit secondo il protocollo del produttore. L'RNA verrà elaborato con il kit di etichettatura dell'RNA Genisphere FlashTag HSR. RNA Spike Control Oligos e code di poli(A) saranno aggiunti a ciascun campione di RNA e una molecola di segnalazione biotinilata sarà ligata all'RNA. I campioni di RNA marcati verranno aggiunti a un cocktail di ibridazione, incubati e iniettati negli array Affymetrix miRNA 2.0. Dopo 16 ore di ibridazione, gli array saranno lavati e colorati su una stazione fluidica Affymetrix 450 utilizzando il protocollo FS450_0003. Gli array verranno scansionati su uno scanner Affymetrix GeneChip 7G Plus. I file cel saranno analizzati utilizzando miRNA QC Tool versione 1.1.1.0.

Verrà impiegata un'ANOVA a 3 vie per valutare l'impatto di ASD, età e sesso sull'espressione del miRNA insieme a un test di Mann Whitney. Gli obiettivi con un valore P <0,05 saranno selezionati per ulteriori analisi dopo la correzione di test multipli con l'analisi di Bonferroni. I miRNA significativamente alterati verranno interrogati su Mirbase.org per i target mRNA noti. L'elenco degli obiettivi verrà quindi esaminato utilizzando lo strumento di annotazione funzionale bioinformatica DAVID per le categorie di ontologia genica arricchita. Le correlazioni tra l'espressione dei miRNA e le caratteristiche mediche/neuropsicologiche saranno calcolate utilizzando la statistica di correlazione di Pearson, filtrando per i miRNA con p-value<0.05 e r > 0,5.