Eksosomal mikroRNA-ekspression hos børn med autismespektrumforstyrrelse

Denne undersøgelse vil rekruttere 20 børn med idiopatisk ASD (defineret af DSM-IV kriterier) og 20 alders- og kønsmatchede kontroller med typiske neuropsykologiske udviklingsmønstre. Antallet af forsøgspersoner, der var nødvendige for denne undersøgelse, blev bestemt ved magtanalyse. Brug af en t-testmodel med to prøver med 15 ASD og 15 kontrolpersoner i hver gruppe ville have 80 % kraft til at detektere ændringer i udtryk svarende til to gange standardafvigelsen af ​​gruppegennemsnittet med Bonferonni korrigeret niveau (p<0,0001) baseret på forventninger om at måle 500 miRNA i hver prøve (Lenth, 2006).

Forældresamtykke og patientsamtykkeformularer vil blive distribueret til potentielle emner på Universitetets Pædiatriske og Unge Center og Center for Udviklingsadfærd og Genetik. For at forklare undersøgelsen vil børn blive fortalt, "Lægerne laver en undersøgelse om en sygdom kaldet autisme. Hvis du ønsker at være med i denne undersøgelse, vil en lille mængde blod blive taget fra din arm med en nål. Nålen vil gøre ondt, men vil gå væk efter lidt tid. Lægerne vil bede dig besvare nogle spørgsmål om, hvordan du har det. Du behøver ikke at være på studiet. Ingen vil være sur på dig, hvis du ikke vil gøre det her."

ASD-emner vil blive vurderet ved hjælp af nuværende metoder inden for autismediagnose: Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS) og Checkliste for Autisme hos småbørn (CHAT). Vineland Behavior Scales vil også blive administreret. Alle indsamlede medicinske oplysninger vil blive kodet og afidentificeret i henhold til standardprotokoller.

Venepunktur vil blive brugt til at opsamle 2 ml blod fra hvert individ i et EDTA-frit vacutainerrør. Prøver efterlades i 1 time ved 37˚C for at tillade koagulering før opbevaring ved 4˚C natten over. Prøven vil derefter blive centrifugeret ved 4000 rpm i 20 minutter ved 4˚C. Serum fjernes fra koaglet ved pipettering og opbevares ved -80˚C, indtil miRNA-ekstraktion udføres.

Beslutningen om at måle exosomal miRNA fra serum understøttes af en undersøgelse af miRNA i 12 menneskelige kropsvæsker. Weber og kolleger (2010) fastslog, at den mediane samlede koncentration af RNA i plasma (308 ug/L) var større end cerebrospinalvæsken (111 ug/L). Desuden fandt forfatterne, at antallet af detekterbare miRNA'er i plasma (349) var større end cerebrospinalvæske (212). MiRNA-indholdet i plasma og cerebrospinalvæske har nogle spændende ligheder. Af de tyve mest udbredte miRNA'er fundet i cerebrospinalvæske og plasma overlapper 9. Vi har tidligere undersøgt ekspressionen af ​​exosomal miRNA i serumet fra humane alkoholikere. Spændende karakteriserede vi ekspressionsniveauerne af hjernespecifikke miRNA'er i serumprøver fra over 30% af de testede. Dette fund viser, at exosomal miRNA'er fra centralnervesystemet kan påvises og kvantificeres i humane blodprøver.

Serum miRNA vil blive ekstraheret ved hjælp af et Qiagen RNeasy Mini Kit i henhold til producentens protokol. RNA vil blive behandlet med Genisphere FlashTag HSR RNA-mærkningssættet. RNA Spike Control Oligos og poly(A)-haler vil blive tilføjet til hver RNA-prøve, og et biotinyleret signalmolekyle vil blive ligeret til RNA'et. De mærkede RNA-prøver vil blive tilføjet til en hybridiseringscocktail, inkuberet og injiceret i Affymetrix miRNA 2.0-arrays. Efter 16 timers hybridisering vil arrays blive vasket og farvet på en Affymetrix fluidikstation 450 ved hjælp af protokol FS450_0003. Arrays vil blive scannet på en Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus. Cel-filerne vil blive analyseret ved hjælp af miRNA QC Tool version 1.1.1.0.

En 3-vejs ANOVA, der vurderer virkningen af ​​ASD, alder og køn på miRNA-ekspression, vil blive anvendt sammen med en Mann Whitney-test. Mål med en P-værdi < 0,05 vil blive udvalgt til yderligere analyse efter multiple testkorrektion med Bonferroni-analyse. Væsentligt ændrede miRNA'er vil blive forespurgt på Mirbase.org for kendte mRNA-mål. Mållisten vil derefter blive undersøgt ved hjælp af DAVID bioinformatik funktionelt annoteringsværktøj for berigede genontologikategorier. Korrelationer mellem miRNA-ekspression og medicinske/neuropsykologiske karakteristika vil blive beregnet ved hjælp af Pearson-korrelationsstatistik, filtrering for miRNA'er med p-værdi <0,05 og r>0,5.