Экзосомальная экспрессия микроРНК у детей с расстройствами аутистического спектра

В этом исследовании примут участие 20 детей с идиопатическим РАС (определяемым критериями DSM-IV) и 20 детей контрольной группы того же возраста и пола с типичными моделями нейропсихологического развития. Количество субъектов, необходимых для этого исследования, было определено с помощью анализа мощности. Использование двухвыборочной модели t-теста с 15 субъектами с РАС и 15 контрольными субъектами в каждой группе будет иметь мощность 80% для обнаружения изменений экспрессии, равных удвоенному стандартному отклонению среднего значения группы с поправкой на уровень Бонферонни (p <0,0001). на основании ожидания измерения 500 микроРНК в каждом образце (Lenth, 2006).

Формы согласия родителей и пациентов будут распространены среди потенциальных испытуемых в Университетском педиатрическом и подростковом центре и Центре развития поведения и генетики. Чтобы объяснить исследование, детям скажут: «Врачи проводят исследование болезни под названием аутизм. Если вы хотите принять участие в этом исследовании, у вас возьмут небольшое количество крови из вашей руки с помощью иглы. Игла будет болеть, но пройдет через некоторое время. Врачи попросят вас ответить на несколько вопросов о том, как вы себя чувствуете. Вам не обязательно находиться в кабинете. Никто не будет злиться на тебя, если ты не захочешь этого делать».

Субъекты с РАС будут оцениваться с использованием современных методов диагностики аутизма: графика наблюдения за диагностикой аутизма (ADOS) и контрольного списка для выявления аутизма у детей раннего возраста (ЧАТ). Также будут применяться шкалы поведения Вайнленда. Вся собранная медицинская информация будет закодирована и обезличена в соответствии со стандартными протоколами.

Будет использоваться венепункция для сбора 2 мл крови от каждого субъекта в пробирку для вакутейнера, не содержащую ЭДТА. Образцы оставляют на 1 час при 37°C для свертывания перед хранением при 4°C в течение ночи. Затем образец центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 минут при 4°C. Сыворотку удаляют из сгустка пипеткой и хранят при температуре -80°C до тех пор, пока не будет проведена экстракция микроРНК.

Решение измерить экзосомальную микроРНК из сыворотки подтверждается исследованием микроРНК в 12 жидкостях человеческого организма. Weber и коллеги (2010) определили, что медиана общей концентрации РНК в плазме (308 мкг/л) была выше, чем в спинномозговой жидкости (111 мкг/л). Кроме того, авт. обнаружили, что количество обнаруживаемых микроРНК в плазме (349) больше, чем в спинномозговой жидкости (212). Содержание miRNA в плазме и спинномозговой жидкости имеет некоторые интригующие сходства. Из двадцати наиболее распространенных микроРНК, обнаруженных в спинномозговой жидкости и плазме, 9 перекрываются. Ранее мы исследовали экспрессию экзосомальной микроРНК в сыворотке людей, страдающих алкоголизмом. Интересно, что мы охарактеризовали уровни экспрессии миРНК, специфичных для мозга, в образцах сыворотки более чем 30% протестированных. Это открытие демонстрирует, что экзосомальные miRNAs из центральной нервной системы могут быть обнаружены и количественно определены в образцах крови человека.

Сывороточная микроРНК будет извлечена с использованием мини-набора Qiagen RNeasy в соответствии с протоколом производителя. РНК будет обработана с помощью набора для мечения РНК Genisphere FlashTag HSR. К каждому образцу РНК будут добавлены контрольные олигонуклеотиды шипа РНК и поли(А) хвосты, а биотинилированная сигнальная молекула будет лигирована с РНК. Образцы меченой РНК будут добавлены в коктейль для гибридизации, инкубированы и введены в матрицы Affymetrix miRNA 2.0. После 16 часов гибридизации матрицы будут промыты и окрашены на жидкостной станции Affymetrix 450 с использованием протокола FS450_0003. Массивы будут сканироваться на сканере Affymetrix GeneChip 7G Plus. Файлы cel будут проанализированы с использованием miRNA QC Tool версии 1.1.1.0.

Вместе с тестом Манна-Уитни будет использоваться трехфакторный дисперсионный анализ, оценивающий влияние РАС, возраста и пола на экспрессию миРНК. Мишени с P-значением <0,05 будут выбраны для дальнейшего анализа после многократной корректировки тестирования с помощью анализа Бонферрони. Значительно измененные микроРНК будут запрашиваться на Mirbase.org для выявления известных целей мРНК. Затем целевой список будет изучен с использованием инструмента функциональной аннотации биоинформатики DAVID для расширенных категорий генной онтологии. Корреляции между экспрессией миРНК и медицинскими/нейропсихологическими характеристиками будут рассчитываться с использованием статистики корреляции Пирсона с фильтрацией миРНК со значением p<0,05. и r>0,5.