Eksosomal mikroRNA-ekspresjon hos barn med autismespektrumforstyrrelse

Denne studien vil rekruttere 20 barn med idiopatisk ASD (definert av DSM-IV-kriterier) og 20 alders- og kjønnsmatchede kontroller med typiske nevropsykologiske utviklingsmønstre. Antall personer som var nødvendige for denne studien ble bestemt ved kraftanalyse. Ved å bruke en t-testmodell med to prøver med 15 ASD og 15 kontrollpersoner i hver gruppe vil det ha 80 % kraft til å oppdage endringer i uttrykk lik to ganger standardavviket til gruppegjennomsnittet med Bonferonni-korrigert nivå (p<0,0001) basert på forventninger om å måle 500 miRNA i hver prøve (Lenth, 2006).

Foreldresamtykke og pasientsamtykkeskjemaer vil bli distribuert til potensielle fag ved Universitetets barne- og ungdomssenter og Senter for utviklingsatferd og genetikk. For å forklare studien vil barn bli fortalt: "Legene gjør en studie om en sykdom som kalles autisme. Hvis du ønsker å være med i denne studien, vil en liten mengde blod bli tatt fra armen din med en nål. Nålen vil gjøre vondt, men vil forsvinne etter en liten stund. Legene vil be deg svare på noen spørsmål om hvordan du har det. Du trenger ikke være på studiet. Ingen vil være sint på deg hvis du ikke vil gjøre dette."

ASD-emner vil bli vurdert ved bruk av gjeldende metoder innen autismediagnostikk: Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS) og Sjekkliste for autisme hos småbarn (CHAT). Vineland Behavior Scales vil også bli administrert. All medisinsk informasjon som samles inn vil bli kodet og avidentifisert i henhold til standardprotokoller.

Venepunktur vil bli brukt for å samle 2 ml blod fra hvert individ i et EDTA-fritt vacutainerrør. Prøvene vil stå i 1 time ved 37˚C for å tillate koagulering før lagring ved 4˚C over natten. Prøven vil deretter bli sentrifugert ved 4000 rpm i 20 minutter ved 4˚C. Serum vil bli fjernet fra koagel ved pipettering og lagret ved -80˚C inntil miRNA-ekstraksjon utføres.

Beslutningen om å måle eksosomalt miRNA fra serum støttes av en studie av miRNA i 12 menneskelige kroppsvæsker. Weber og medarbeidere (2010) fastslo at median totalkonsentrasjon av RNA i plasma (308 ug/L) var større enn cerebrospinalvæske (111 ug/L). Videre fant forfatterne at antallet påvisbare miRNA i plasma (349) var større enn cerebrospinalvæske (212). MiRNA-innholdet i plasma og cerebrospinalvæske har noen spennende likheter. Av de tjue mest tallrike miRNAene som finnes i cerebrospinalvæske og plasma, overlapper 9. Vi har tidligere undersøkt uttrykket av eksosomal miRNA i serumet til mennesker med alkoholholdige personer. Interessant nok karakteriserte vi ekspresjonsnivåene til hjernespesifikke miRNA-er i serumprøver fra over 30 % av de som ble testet. Dette funnet viser at eksosomal miRNA fra sentralnervesystemet kan påvises og kvantifiseres i humane blodprøver.

Serum miRNA vil bli ekstrahert med et Qiagen RNeasy Mini Kit i henhold til produsentens protokoll. RNA vil bli behandlet med Genisphere FlashTag HSR RNA-merkingssettet. RNA Spike Control Oligos og poly(A)-haler vil bli lagt til hver RNA-prøve, og et biotinylert signalmolekyl vil bli ligert til RNA. De merkede RNA-prøvene vil bli lagt til en hybridiseringscocktail, inkubert og injisert i Affymetrix miRNA 2.0-matriser. Etter 16 timers hybridisering vil arrayene vaskes og farges på en Affymetrix fluidikkstasjon 450 ved bruk av protokollen FS450_0003. Arrays vil bli skannet på en Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus. Cel-filene vil bli analysert med miRNA QC Tool versjon 1.1.1.0.

En 3-veis ANOVA som vurderer virkningen av ASD, alder og kjønn på miRNA-ekspresjon vil bli brukt sammen med en Mann Whitney-test. Mål med en P-verdi < 0,05 vil bli valgt for videre analyse etter multiple testkorreksjon med Bonferroni-analyse. Betydelig endrede miRNA-er vil bli forespurt på Mirbase.org for kjente mRNA-mål. Mållisten vil deretter bli undersøkt ved å bruke DAVID bioinformatikk funksjonelt annoteringsverktøy for berikede genontologikategorier. Korrelasjoner mellom miRNA-uttrykk og medisinske/nevropsykologiske egenskaper vil bli beregnet ved hjelp av Pearson-korrelasjonsstatistikk, filtrering etter miRNA med p-verdi <0,05 og r>0,5.