Exosomale MicroRNA-Expression bei Kindern mit Autismus-Spektrum-Störung

Für diese Studie werden 20 Kinder mit idiopathischer ASD (definiert durch DSM-IV-Kriterien) und 20 alters- und geschlechtsangepasste Kontrollpersonen mit typischen neuropsychologischen Entwicklungsmustern rekrutiert. Die Anzahl der für diese Studie erforderlichen Probanden wurde durch eine Leistungsanalyse ermittelt. Die Verwendung eines T-Test-Modells mit zwei Stichproben und 15 ASD- und 15 Kontrollpersonen in jeder Gruppe hätte eine Aussagekraft von 80 % zum Erkennen von Expressionsänderungen, die dem Doppelten der Standardabweichung des Gruppenmittelwerts mit Bonferonni-korrigiertem Niveau (p < 0,0001) entsprächen. basierend auf der Erwartung, 500 miRNA in jeder Probe zu messen (Lenth, 2006).

Formulare zur Einverständniserklärung der Eltern und zum Einverständnis des Patienten werden an potenzielle Probanden im Zentrum für Kinder- und Jugendheilkunde der Universität und im Zentrum für Entwicklungsverhalten und Genetik verteilt. Um die Studie zu erklären, wird den Kindern gesagt: „Die Ärzte führen eine Studie über eine Krankheit namens Autismus durch.“ Wenn Sie an dieser Studie teilnehmen möchten, wird Ihnen mit einer Nadel eine kleine Menge Blut aus dem Arm entnommen. Die Nadel tut weh, verschwindet aber nach einer Weile. Die Ärzte werden Sie bitten, einige Fragen zu Ihrem Befinden zu beantworten. Sie müssen nicht im Arbeitszimmer sein. Niemand wird dir böse sein, wenn du das nicht willst.

ASD-Patienten werden anhand aktueller Methoden der Autismusdiagnose beurteilt: dem Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS) und der Checklist for Autism in Toddlers (CHAT). Die Vineland Behavior Scales werden ebenfalls verabreicht. Alle gesammelten medizinischen Informationen werden gemäß Standardprotokollen kodiert und anonymisiert.

Mittels Venenpunktion werden von jedem Probanden 2 ml Blut in ein EDTA-freies Vacutainer-Röhrchen entnommen. Die Proben werden 1 Stunde lang bei 37 °C belassen, um die Gerinnung zu ermöglichen, bevor sie über Nacht bei 4 °C gelagert werden. Anschließend wird die Probe 20 Minuten lang bei 4 °C und 4.000 U/min zentrifugiert. Das Serum wird durch Pipettieren aus dem Gerinnsel entfernt und bei -80 °C gelagert, bis die miRNA-Extraktion durchgeführt wird.

Die Entscheidung, exosomale miRNA aus Serum zu messen, wird durch eine Studie von miRNA in 12 menschlichen Körperflüssigkeiten gestützt. Weber und Kollegen (2010) stellten fest, dass die mittlere Gesamtkonzentration von RNA im Plasma (308 µg/L) höher war als die der Liquor cerebrospinalis (111 µg/L). Darüber hinaus stellten die Autoren fest, dass die Anzahl der nachweisbaren miRNAs im Plasma (349) größer ist als in der Liquor cerebrospinalis (212). Der miRNA-Gehalt von Plasma und Liquor weist einige interessante Ähnlichkeiten auf. Von den zwanzig am häufigsten in Liquor und Plasma vorkommenden miRNAs überlappen sich neun. Wir haben zuvor die Expression exosomaler miRNA im Serum menschlicher Alkoholiker untersucht. Interessanterweise haben wir die Expressionsniveaus gehirnspezifischer miRNAs in Serumproben von über 30 % der getesteten Personen charakterisiert. Dieser Befund zeigt, dass exosomale miRNAs aus dem Zentralnervensystem in menschlichen Blutproben nachgewiesen und quantifiziert werden können.

Serum-miRNA wird mit einem Qiagen RNeasy Mini Kit gemäß dem Herstellerprotokoll extrahiert. Die RNA wird mit dem Genisphere FlashTag HSR RNA-Markierungskit verarbeitet. Jeder RNA-Probe werden RNA-Spike-Kontrolloligos und Poly(A)-Schwänze hinzugefügt, und ein biotinyliertes Signalmolekül wird an die RNA ligiert. Die markierten RNA-Proben werden einem Hybridisierungscocktail hinzugefügt, inkubiert und in Affymetrix miRNA 2.0-Arrays injiziert. Nach 16 Stunden Hybridisierung werden die Arrays auf einer Affymetrix Fluidics Station 450 unter Verwendung des Protokolls FS450_0003 gewaschen und gefärbt. Arrays werden mit einem Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus gescannt. Die Cel-Dateien werden mit miRNA QC Tool Version 1.1.1.0 analysiert.

Eine 3-Wege-ANOVA zur Bewertung des Einflusses von ASD, Alter und Geschlecht auf die miRNA-Expression wird zusammen mit einem Mann-Whitney-Test eingesetzt. Ziele mit einem P-Wert < 0,05 werden nach mehrfacher Testkorrektur mit Bonferroni-Analyse für die weitere Analyse ausgewählt. Signifikant veränderte miRNAs werden auf Mirbase.org nach bekannten mRNA-Zielen abgefragt. Die Zielliste wird dann mit dem DAVID Bioinformatics Functional Annotation Tool auf angereicherte Genontologiekategorien untersucht. Korrelationen zwischen miRNA-Expression und medizinischen/neuropsychologischen Merkmalen werden mithilfe der Pearson-Korrelationsstatistik berechnet, wobei nach miRNAs mit einem p-Wert <0,05 gefiltert wird und r>0,5.