Exosomale microRNA-expressie bij kinderen met autismespectrumstoornis

Deze studie zal 20 kinderen rekruteren met idiopathische ASS (gedefinieerd door DSM-IV-criteria) en 20 op leeftijd en geslacht afgestemde controles met typische neuropsychologische ontwikkelingspatronen. Het aantal proefpersonen dat nodig was voor dit onderzoek werd bepaald door middel van poweranalyse. Het gebruik van een t-testmodel met twee steekproeven met 15 ASS en 15 controlepersonen in elke groep zou 80% vermogen hebben om veranderingen in expressie te detecteren gelijk aan tweemaal de standaarddeviatie van het groepsgemiddelde met Bonferonni-gecorrigeerd niveau (p<0,0001) gebaseerd op de verwachting van het meten van 500 miRNA in elk monster (Lenth, 2006).

Ouderlijke toestemming en toestemmingsformulieren voor patiënten zullen worden uitgedeeld aan potentiële proefpersonen in het Universitair Pediatrisch en Adolescentencentrum en het Centrum voor Ontwikkelingsgedrag en Genetica. Om de studie uit te leggen, zullen kinderen worden verteld: "De doktoren doen een studie over een ziekte die autisme wordt genoemd. Als u in dit onderzoek wilt zijn, wordt er met een naald een kleine hoeveelheid bloed uit uw arm afgenomen. De naald zal pijn doen, maar zal na een tijdje verdwijnen. De artsen zullen u vragen enkele vragen te beantwoorden over hoe u zich voelt. Je hoeft niet in de studeerkamer te zijn. Niemand zal boos op je zijn als je dit niet wilt doen."

ASS-patiënten zullen worden beoordeeld met behulp van de huidige methoden in de diagnose van autisme: het Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS) en de Checklist Autism in Toddlers (CHAT). Ook worden de Vineland Gedragsschalen afgenomen. Alle verzamelde medische informatie wordt gecodeerd en geanonimiseerd volgens standaardprotocollen.

Venapunctie zal worden gebruikt om 2 ml bloed van elke proefpersoon te verzamelen in een EDTA-vrije vacutainerbuis. Monsters worden gedurende 1 uur bij 37°C bewaard om stolling mogelijk te maken voordat ze een nacht bij 4°C worden bewaard. Het monster wordt vervolgens gedurende 20 minuten bij 4°C gecentrifugeerd bij 4000 rpm. Serum wordt door pipetteren uit het stolsel verwijderd en bewaard bij -80˚C totdat miRNA-extractie is uitgevoerd.

De beslissing om exosomaal miRNA uit serum te meten wordt ondersteund door een studie van miRNA in 12 menselijke lichaamsvloeistoffen. Weber en collega's (2010) stelden vast dat de mediane totale concentratie van RNA in plasma (308 ug/L) hoger was dan die van cerebrospinale vloeistof (111 ug/L). Bovendien vonden de auteurs dat het aantal detecteerbare miRNA's in plasma (349) groter was dan in hersenvocht (212). Het miRNA-gehalte van plasma en hersenvocht heeft enkele intrigerende overeenkomsten. Van de twintig meest voorkomende miRNA's die in cerebrospinale vloeistof en plasma worden gevonden, overlappen er 9 elkaar. We hebben eerder de expressie van exosomaal miRNA in het serum van menselijke alcoholische proefpersonen onderzocht. Intrigerend genoeg karakteriseerden we de expressieniveaus van hersenspecifieke miRNA's in serummonsters van meer dan 30% van de geteste personen. Deze bevinding toont aan dat exosomale miRNA's van het centrale zenuwstelsel kunnen worden gedetecteerd en gekwantificeerd in menselijke bloedmonsters.

Serum miRNA zal worden geëxtraheerd met behulp van een Qiagen RNeasy Mini Kit volgens het protocol van de fabrikant. RNA wordt verwerkt met de Genisphere FlashTag HSR RNA labeling kit. RNA Spike Control Oligo's en poly(A)-staarten zullen aan elk RNA-monster worden toegevoegd en een gebiotinyleerd signaalmolecuul zal aan het RNA worden geligeerd. De gelabelde RNA-monsters worden toegevoegd aan een hybridisatiecocktail, geïncubeerd en geïnjecteerd in Affymetrix miRNA 2.0-arrays. Na 16 uur hybridisatie worden de arrays gewassen en gekleurd op een Affymetrix fluidics station 450 met behulp van protocol FS450_0003. Arrays worden gescand op een Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus. De celbestanden worden geanalyseerd met miRNA QC Tool versie 1.1.1.0.

Een 3-weg ANOVA die de impact van ASS, leeftijd en geslacht op miRNA-expressie beoordeelt, zal samen met een Mann Whitney-test worden gebruikt. Doelen met een P-waarde < 0,05 worden geselecteerd voor verdere analyse na meervoudige testcorrectie met Bonferroni-analyse. Aanzienlijk gewijzigde miRNA's zullen op Mirbase.org worden opgevraagd voor bekende mRNA-doelen. De doellijst zal vervolgens worden onderzocht met behulp van DAVID bioinformatica functionele annotatietool voor verrijkte genontologiecategorieën. Correlaties tussen miRNA-expressie en medische/neuropsychologische kenmerken zullen worden berekend met behulp van Pearson Correlation-statistieken, filtering op miRNA's met p-waarde <0,05 en r>0,5.