Expressão de MicroRNA Exossomal em Crianças com Transtorno do Espectro Autista

Este estudo recrutará 20 crianças com TEA idiopático (definido pelos critérios do DSM-IV) e 20 controles pareados por idade e gênero com padrões típicos de desenvolvimento neuropsicológico. O número de sujeitos necessários para este estudo foi determinado pela análise de poder. O uso de um modelo de teste t de duas amostras com 15 ASD e 15 indivíduos de controle em cada grupo teria 80% de poder para detectar mudanças na expressão igual a duas vezes o desvio padrão da média do grupo com nível corrigido de Bonferonni (p <0,0001) com base na expectativa de medir 500 miRNA em cada amostra (Lenth, 2006).

O consentimento dos pais e os formulários de assentimento do paciente serão distribuídos a possíveis sujeitos no Centro de Pediatria e Adolescentes da Universidade e no Centro de Desenvolvimento Comportamental e Genética. Para explicar o estudo, será dito às crianças: "Os médicos estão fazendo um estudo sobre uma doença chamada autismo. Se você quiser participar deste estudo, uma pequena quantidade de sangue será retirada de seu braço com uma agulha. A agulha vai doer, mas vai embora depois de um tempo. Os médicos pedirão que você responda a algumas perguntas sobre como você se sente. Você não precisa estar no estudo. Ninguém vai ficar com raiva de você se você não quiser fazer isso."

Indivíduos com TEA serão avaliados usando métodos atuais no diagnóstico de autismo: o Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS) e o Checklist para Autismo em Crianças (CHAT). As Escalas de Comportamento Vineland também serão administradas. Todas as informações médicas coletadas serão codificadas e desidentificadas de acordo com os protocolos padrão.

A punção venosa será empregada para coletar 2ml de sangue de cada indivíduo em um tubo vacutainer sem EDTA. As amostras serão deixadas por 1 hora a 37˚C para permitir a coagulação antes do armazenamento a 4˚C durante a noite. A amostra será então centrifugada a 4000 rpm por 20 minutos a 4˚C. O soro será removido do coágulo por pipetagem e armazenado a -80˚C até que a extração do miRNA seja realizada.

A decisão de medir o miRNA exossomal do soro é apoiada por um estudo do miRNA em 12 fluidos corporais humanos. Weber e colegas (2010) determinaram que a concentração média total de RNA no plasma (308 ug/L) era maior do que no líquido cefalorraquidiano (111 ug/L). Além disso, os autores descobriram que o número de miRNAs detectáveis ​​no plasma (349) é maior do que no líquido cefalorraquidiano (212). O conteúdo de miRNA do plasma e do líquido cefalorraquidiano tem algumas semelhanças intrigantes. Dos vinte miRNAs mais abundantes encontrados no líquido cefalorraquidiano e no plasma, 9 se sobrepõem. Anteriormente, examinamos a expressão de miRNA exossomal no soro de alcoólatras humanos. Curiosamente, caracterizamos os níveis de expressão de miRNAs específicos do cérebro em amostras de soro de mais de 30% das testadas. Esta descoberta demonstra que miRNAs exossomais do sistema nervoso central podem ser detectados e quantificados em amostras de sangue humano.

O miRNA sérico será extraído usando um Qiagen RNeasy Mini Kit de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA será processado com o kit de rotulagem Genisphere FlashTag HSR RNA. RNA Spike Control Oligos e caudas poli(A) serão adicionados a cada amostra de RNA e uma molécula sinalizadora biotinilada será ligada ao RNA. As amostras de RNA marcadas serão adicionadas a um coquetel de hibridação, incubadas e injetadas em matrizes Affymetrix miRNA 2.0. Após 16 horas de hibridação, os arrays serão lavados e corados em uma estação fluídica Affymetrix 450 utilizando o protocolo FS450_0003. As matrizes serão digitalizadas em um Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus. Os arquivos cel serão analisados ​​usando miRNA QC Tool versão 1.1.1.0.

Uma ANOVA de 3 vias avaliando o impacto do TEA, idade e gênero na expressão do miRNA será empregada junto com um teste de Mann Whitney. Os alvos com valor P < 0,05 serão selecionados para análise posterior após correção de teste múltiplo com análise de Bonferroni. MiRNAs significativamente alterados serão consultados em Mirbase.org para alvos de mRNA conhecidos. A lista de alvos será então examinada usando a ferramenta de anotação funcional de bioinformática DAVID para categorias de ontologia genética enriquecidas. As correlações entre a expressão do miRNA e as características médicas/neuropsicológicas serão calculadas usando estatísticas de Correlação de Pearson, filtrando para miRNAs com valor p<0,05 e r>0,5.