자폐 스펙트럼 장애 아동의 엑소좀 마이크로RNA 발현

이 연구는 특발성 ASD(DSM-IV 기준에 의해 정의됨)가 있는 20명의 아동과 전형적인 신경심리학적 발달 패턴을 가진 20명의 연령 및 성별 일치 대조군을 모집합니다. 본 연구에 필요한 피험자 수는 검정력 분석을 통해 결정하였다. 각 그룹에서 15명의 ASD와 15명의 통제 대상이 있는 2개 샘플 t-테스트 모델을 사용하면 Bonferonni 보정 수준(p<0.0001)을 사용하여 그룹 평균의 표준 편차의 두 배에 해당하는 표현의 변화를 감지하는 80% 검정력을 갖게 됩니다. 각 샘플에서 500개의 miRNA를 측정할 것이라는 예상을 기반으로 합니다(Lenth, 2006).

부모 동의서 및 환자 동의서 양식은 University Pediatric and Adolescent Center와 Center for Development Behavior and Genetics의 잠재적 과목에 배포됩니다. 연구를 설명하기 위해 아이들은 "의사들이 자폐증이라는 질병에 대한 연구를 하고 있습니다. 이 연구에 참여하기를 원하시면 바늘로 팔에서 소량의 혈액을 채취합니다. 바늘이 아프지만 잠시 후 사라집니다. 의사는 귀하의 기분에 대한 몇 가지 질문에 답하도록 요청할 것입니다. 연구에 참여하지 않아도 됩니다. 당신이 이것을 원하지 않는다면 아무도 당신에게 화를 내지 않을 것입니다."

ASD 피험자는 자폐 진단의 현재 방법인 ADOS(Autism Diagnostic Observation Schedule) 및 CHAT(Checklist for Autism in Toddlers)를 사용하여 평가됩니다. Vineland 행동 척도도 시행됩니다. 수집된 모든 의료 정보는 표준 프로토콜에 따라 암호화되고 비식별화됩니다.

Venipuncture는 EDTA가 없는 vacutainer 튜브에 각 피험자로부터 2ml의 혈액을 수집하는 데 사용됩니다. 샘플을 37˚C에서 1시간 동안 방치하여 밤새 4˚C에서 보관하기 전에 응고되도록 합니다. 그런 다음 샘플을 4˚C에서 20분 동안 4000rpm으로 원심분리합니다. 피펫팅을 통해 혈전에서 혈청을 제거하고 miRNA 추출을 수행할 때까지 -80˚C에서 보관합니다.

혈청에서 엑소좀 miRNA를 측정하기로 한 결정은 12가지 인체 체액의 miRNA 연구에 의해 뒷받침됩니다. Weber와 동료들(2010)은 혈장(308 ug/L) 내 RNA의 중간 총 농도가 뇌척수액(111 ug/L)보다 크다고 결정했습니다. 또한 저자는 혈장(349개)에서 검출 가능한 miRNA의 수가 뇌척수액(212개)보다 많다는 것을 발견했습니다. 혈장과 뇌척수액의 miRNA 함량에는 몇 가지 흥미로운 유사점이 있습니다. 뇌척수액과 혈장에서 발견되는 가장 풍부한 20개의 miRNA 중 9개가 겹칩니다. 우리는 이전에 인간 알코올 중독자의 혈청에서 엑소좀 miRNA의 발현을 조사했습니다. 흥미롭게도, 우리는 테스트된 샘플의 30% 이상에서 얻은 혈청 샘플에서 뇌 특이 miRNA의 발현 수준을 특성화했습니다. 이 발견은 중추 신경계의 엑소좀 miRNA가 인간 혈액 샘플에서 검출되고 정량화될 수 있음을 보여줍니다.

제조업체 프로토콜에 따라 Qiagen RNeasy Mini Kit를 사용하여 혈청 miRNA를 추출합니다. RNA는 Genisphere FlashTag HSR RNA 라벨링 키트로 처리됩니다. RNA Spike Control Oligos 및 poly(A) tail이 각 RNA 샘플에 추가되고 biotinylated 신호 분자가 RNA에 결찰됩니다. 표지된 RNA 샘플은 혼성화 칵테일에 추가되고 배양되며 Affymetrix miRNA 2.0 어레이에 주입됩니다. 혼성화 16시간 후, 프로토콜 FS450_0003을 사용하여 Affymetrix 유체역학 스테이션 450에서 어레이를 세척하고 염색할 것입니다. 배열은 Affymetrix GeneChip Scanner 7G Plus에서 스캔됩니다. miRNA QC Tool 버전 ​​1.1.1.0을 사용하여 cel 파일을 분석합니다.

ASD, 연령 및 성별이 miRNA 발현에 미치는 영향을 평가하는 3원 ANOVA가 Mann Whitney 테스트와 함께 사용될 것입니다. P-값이 0.05 미만인 대상은 Bonferroni 분석으로 여러 테스트 수정 후 추가 분석을 위해 선택됩니다. 크게 변경된 miRNA는 알려진 mRNA 표적에 대해 Mirbase.org에서 쿼리됩니다. 대상 목록은 풍부한 유전자 온톨로지 범주에 대한 DAVID 생물 정보학 기능 주석 도구를 사용하여 검사됩니다. miRNA 발현과 의학적/신경심리학적 특성 사이의 상관관계는 p-값이 0.05 미만인 miRNA에 대해 필터링하는 Pearson Correlation 통계를 사용하여 계산됩니다. 및 r > 0.5.