多発血管炎性肉芽腫症（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれていた）における予後因子としての好中球 (NeutroVasc)

A - 特定の目的 一般的な目的: このプロジェクトは、GPA に関与する生理病理学的メカニズムを細胞および分子レベルで研究することを目的としています。 研究者たちは、好中球を予後因子として研究し、炎症の消散段階における主要な自己抗原である PR3 の意味を明らかにしたいと考えています。

研究者の作業仮説は、好中球における PR3 の構造的および機能的分析が、研究者が GPA における PR3 の役割を解明するのに役立つというものです。 したがって、私たちの長期的な目的は、好中球の膜でのPR3発現の調節に関与するメカニズムをよりよく理解し、それらの活性化を阻害し、GPAに適応した新しい抗炎症治療戦略を提案することです.

現在のプロジェクト: 研究者らは最近、ヒト好中球において、i) PR3は脱顆粒の非存在下でアポトーシス中に好中球の膜で発現できること、ii) PR3はリン脂質スクランブラーゼ1 (スクランブラーゼ) およびアポトーシス中に外部化されたカルレティキュリンを含む分子足場のメンバーであることを実証した。 , iii) アポトーシス誘導 PR3 膜発現は、アポトーシス好中球の食作用後のマクロファージ再プログラミングを損なう 研究者の仮説は、PR3 は、好中球アポトーシス中の原形質膜での外在化および/または持続性を促進できる特定の分子パートナーを持っているため、その自動を増強する可能性があるというものです。 -抗原能力。

具体的な目的は次のとおりです。

1. GPA 患者の好中球におけるアポトーシスの特徴付け
2. PR3 パートナー (CD16、CD11b、Calreticulin、Phospholipidscramblase1) または GPA 患者の好中球における共発現炎症タンパク質 (AnnexinA1) の発現を健常対照者と比較した分析
3. 好中球におけるPR3の新しいパートナーの同定
4. GPA患者の好中球のプロテオーム解析

B. 背景と意義 1.1. はじめに GPA は、主に抗 PR3 ANCA に関連する全身性血管炎です。 血管炎病変における活性化好中球の役割は、血管周囲浸潤、特に腎臓糸球体および肺におけるそれらの存在によって示唆されています。

PR3は、好中球のアズール顆粒内で最初に記述されたセリンプロテアーゼであり、原形質膜と融合することは想定されていませんが、病原体の貪食後にファゴリソソーム内で放出されます。 以前に考えられていたように、PR3の細胞内局在はアズール顆粒に限定されていなかったが、PR3は非常に可動性の高いコンパートメントである分泌小胞に局在していたことを初めて示した。好中球。 さらに、血管炎患者で観察されるPR3を発現する好中球の割合が高いことは、血管炎の危険因子と見なすことができます。 GPA患者におけるこの膜PR3の高発現は、好中球におけるANCA誘発性呼吸バーストの増加をもたらし、炎症プロセスを強化しました。 インビトロで、ANCAのPR3への結合は、呼吸バースト、脱顆粒、および炎症誘発性サイトカインの放出を引き起こします。

PR3膜の発現は、その後のANCAによる好中球の活性化の前提条件であるため、GPAの重要な病態生理学的イベントであるため、PR3膜の発現に関与するメカニズムを決定しようとしました。 好中球では、アポトーシスが脱顆粒なしで膜 PR3 発現の有意な増加を引き起こすことを実証しました。 これらの実験では、好中球の膜で MPO を検出できませんでした。 我々の結果は、MPOとPR3の両方が細胞膜へのアズール顆粒の転座のためにアポトーシス中に外部化されたことを示す以前に報告されたデータとは異なります。 この現象は、好中球が後期アポトーシスおよび二次壊死を起こし、細胞表面のすべての顆粒タンパク質の発現につながるときに発生するようです。

アポトーシス誘導の PR3 外在化は、GPA の病態生理学に大きく関連している可能性があります。これは、細胞内抗原であると考えられていた PR3 がアポトーシス細胞の原形質膜に露出し、その結果、その炎症誘発性、免疫原性および干渉性が増幅されるためです。マクロファージ食作用を伴う。 また、アポトーシス中にPR3の発現が、よく知られている「eat-meシグナル」であるカルレティキュリンの発現と関連していることも実証しました。 我々は最終的に、CRT/LRP経路を介したアポトーシス細胞の食作用の後、PR3の存在がマクロファージの抗炎症プロファイルへの再プログラミングを損なうことを証明しました。

アポトーシス好中球の表面での複雑な PR3/スクランブラーゼ/CRT およびその他のパートナー (CD11b、CD16) の発現は、良好な予後マーカーを構成する可能性があるという仮説を立てることができます.遺伝子アレイ研究は、GPA における好中球の規制緩和を指摘しています。 GPA患者の好中球のプロテオームは、その活性化状態、生存状態について非常に有益であり、臨床的重症度の生物学的マーカーになる可能性があるという仮説を立てています.

したがって、好中球のすべてのライフ サイクルにおける調節解除を研究することは適切です: 活性化下での酸化的バースト、生理学的アポトーシス、PR3 パートナーの発現。 この研究は、年齢および性別を調整した健康な対照と比較して、GPA患者の好中球で実施されます。

C. 予備研究 GPA 患者からの好中球におけるアポトーシスの分析 文献では、ANCA 関連血管炎 (AAV) 患者からの好中球は、TNFα 誘導性アポトーシスが乱されており、対照よりもアポトーシス率が高い傾向があることがわかっています。 しかし、好中球が外因性刺激の非存在下で受ける自発的なアポトーシスである生理学的アポトーシスに関する公開データは矛盾しています。 子ウシ胎児血清を培地に添加すると、GPA 患者の好中球は対照と同様のアポトーシス率を示します。 患者の血清を使用すると、寛解期の AAV 患者の好中球は対照よりも in vivo での生存率が高く、正常な血清を使用するとこの差はなくなります。 これらの結果は、GPA 患者が生存に関連する PCNA を高発現しているという発見と一致しています。 したがって、診断時、再発中、および全血での寛解後のGPAにおける好中球のアポトーシス率を研究したいと考えています。 これらの結果は、年齢と性別が一致したコントロールと比較されます。 アポトーシスは、CD15+ 細胞に対するアネキシン V 標識および 7-AAD 染色後にフローサイトメトリーによって測定されるホスファチジルセリン外在化によって評価されます。 PCNA 発現もさまざまな臨床段階で調査され、アポトーシス好中球のプロテオミクスプロファイルが実行されます。

GPA 患者の好中球におけるスクランブラーゼ/カルレティキュリン発現の分析 細胞モデル (RBL 細胞株) で、shRNA によるスクランブラーゼの消滅は、アポトーシス中のホスファチジルセリンの発現の減少と関連し、PR3 アポトーシスによって誘導される発現も損なわれることを実証しました (未発表データ）。 また、in vitro スクランブラーゼと PR3 が物理的に相互作用することを実証することもできました。 アポトーシスの間、PR3は好中球の膜でカルレティキュリンとも関連しています。 これらのデータは、PR3/スクラムブラーゼ/カルレティキュリンの関連が、マクロファージとアポトーシス好中球の間の認識経路 (CRT/LRP など) を妨害する可能性のある機能的プラットフォームである分子足場を形成することを示唆しています。 アポトーシス中の好中球膜でのこれらのパートナーの発現は、診断時および寛解が得られたときに患者で調査されます。

研究デザインと方法:

1. GPA 患者の好中球におけるアポトーシスの特徴付け 全血中の好中球のアポトーシス率を決定します。

   方法論:

   研究は、フランスの血液研究所 (Etablissement Français du Sang) で得られた健康な対照ドナーから分離された好中球と、ロイック・ギユヴァン教授が率いるコーチン病院の内科の血管炎患者から分離された好中球の両方で行われます。

   アポトーシスは、37℃で一晩インキュベーションすることにより、全血で「生理学的に」誘導されます。

   ホスファチジルセリン外在化は、CD15 + 細胞の 7-AAD 染色に関連するアネキシン V 標識の後、フローサイトメトリーによって測定されます。

   PCNAに対する特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析も、その発現を視覚化するために使用されます。

2. スクランブラーゼ、PR3、カルレティキュリン、アネキシン A1、GPA 患者のアポトーシス好中球における発現の分析 好中球のさまざまなサブセットのアポトーシス好中球における PR3、CRT、PLSCR、AxA1 の膜発現を決定します。 -)、初期アポトーシス好中球 (AnnexinV+、7AAD-) および後期アポトーシス好中球 (AnnexinV+、7AAD+)。 この決定は、診断時（活動状態; BVAS> 3）および寛解時に患者に対して行われます。

   方法論

   • 好中球は、デキストラン勾配と Ficoll を使用して血液から分離されます。
   • PR3、CRT、PLSCR、AxA1、膜発現の調査は、アネキシン-V 標識および 7AAD 染色によるアポトーシスの評価とともに、37°C​​ で一晩インキュベーションした後、フローサイトメトリーによって単離された好中球で測定されます。

3. GPA 患者の好中球における呼吸バーストの研究 好中球の主な機能の 1 つは、活性酸素種の生成です。さまざまな刺激 (f-MLP、補体によるオプソニン化ザイモサン ビーズ、オプソニン化ザイモサンIgG、PMA によるビーズ) TNFα による以前のプライミングの有無にかかわらず。

   方法論:

   呼吸バーストの調査は、化学発光 (ルミノール) 技術を使用して全血で行われます。 好中球は、TNFαによってプライミングされるか、プライミングなしで刺激されます。 バースト応答は、刺激後 90 分間分析されます。

4. 好中球サイトキノームの調節解除 好中球は、多数のサイトカイン (IL-1、TNFα、IL-6、IL-12)、GM-CSF などの成長因子、および IL-8 などのチミオカインを合成することができます。 最近では、好中球もBAFF（B細胞活性化因子）の優れた生産者であり、INF-γによって刺激された場合、生産は単球または樹状細胞による生産よりも優れていることが示されています。 GPA では、血清 BAFF レベルはコントロールよりも高いことが示され、最近では B リンパ球を標的とする治療薬が大規模な対照試験で AAV におけるその重要性を確認しています。

   方法論:

   患者の血清は、好中球と同時に収集されます。 これらは、IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF、および IL-12p70 を検出する BD™ Cytometric Bead Array (CBA) を使用して分析されます。 １）のように単離される好中球は、ＥＬＩＳＡによって決定されるＢＡＦＦ／ＢｌｙＳの産生および分泌を分析するために、ＩＮＦ－γ、ＬＰＳおよびＧ－ＣＳＦによって刺激される。

5. 好中球プロテオームの規制緩和と新しい PR3 パートナーの機能研究 遺伝子アレイ研究により、AAV における好中球の規制緩和の可能性が示されました。この研究では、この規制緩和をタンパク質レベルで研究します。

方法論:

GPA患者のプロテオームを研究するために、アクティブで寛解しているときに健康なコントロールと比較して、超音波処理によって得られた好中球のサイトゾルサンプルのゲル電気泳動の差異を使用します。 目的のタンパク質の同定は、質量分析 MALDI-TOF-TOF によって行われます。 過剰発現または siRNA 絶滅によるこれらのタンパク質の機能検証が行われます。