Neutrophile als prognostische Faktoren bei Granulomatose mit Polyangiitis (früher als Wegener-Granulomatose bezeichnet) (NeutroVasc)

A - Spezifische Ziele Allgemeines Ziel: Dieses Projekt dient der Untersuchung physiopathologischer Mechanismen, die an der GPA auf zellulärer und molekularer Ebene beteiligt sind. Die Forscher wollen Neutrophile als prognostische Faktoren untersuchen und die Auswirkungen von PR3, dem wichtigsten Autoantigen, in der Auflösungsphase von Entzündungen bestimmen.

Die Arbeitshypothese der Forscher ist, dass die Struktur- und Funktionsanalyse von PR3 in Neutrophilen den Forschern helfen wird, seine Rolle bei GPA zu enträtseln. Daher ist es unser langfristiges Ziel, die Mechanismen, die an der Modulation der PR3-Expression an der Membran von Neutrophilen beteiligt sind, besser zu verstehen, um ihre Aktivierung zu hemmen und neue entzündungshemmende therapeutische Strategien vorzuschlagen, die an GPA angepasst sind.

Aktuelles Projekt: Die Forscher zeigten kürzlich, dass in menschlichen Neutrophilen i) PR3 an der Membran von Neutrophilen während der Apoptose ohne Degranulation exprimiert werden kann, ii) PR3 ein Mitglied eines molekularen Gerüsts ist, das Phospholipidscramblase1 (Scramblase) und Calreticulin umfasst, das während der Apoptose externalisiert wird , iii) Apoptose-induzierte PR3-Membranexpression beeinträchtigt Makrophagen-Reprogrammierung nach Phagozytose von apoptotischen Neutrophilen Die Hypothese der Forscher ist, dass PR3 spezifische molekulare Partner haben könnte, die seine Externalisierung und/oder seine Persistenz an der Plasmamembran während der Apoptose von Neutrophilen erleichtern und so seine Auto -antigene Kapazität.

Die konkreten Ziele sind:

1. Charakterisierung der Apoptose in Neutrophilen von GPA-Patienten
2. Analyse von PR3-Partnern (CD16, CD11b, Calreticulin, Phospholipidscramblase1) oder co-exprimiertem Protein of Interest in Inflammation (AnnexinA1), Expression in Neutrophilen von Patienten mit GPA im Vergleich zu gesunden Kontrollen
3. Identifizierung neuer Partner von PR3 in Neutrophilen
4. Analyse des Proteoms von Neutrophilen von GPA-Patienten

B. Hintergrund und Bedeutung 1.1. Einleitung GPA ist eine systemische Vaskulitis, die hauptsächlich mit Anti-PR3-ANCA assoziiert ist. Die Rolle von aktivierten Neutrophilen bei Vaskulitisläsionen wird durch ihre Anwesenheit in perivaskulären Infiltraten, insbesondere in Nierenglomeruli und in der Lunge, nahegelegt.

PR3 ist eine Serinprotease, die erstmals in azurophilen Granula von Neutrophilen beschrieben wurde, die NICHT mit der Plasmamembran fusionieren sollen, sondern innerhalb des Phagolysosoms nach der Phagozytose des Pathogens freigesetzt werden. Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass die subzelluläre Lokalisierung von PR3 nicht auf azurophile Granula beschränkt war, wie zuvor angenommen, sondern dass PR3 in sekretorischen Vesikeln lokalisiert war, einem hochgradig mobilisierbaren Kompartiment, was das Vorhandensein von PR3 an der Oberfläche erklärt, wenn es isoliert ruht Neutrophile. Darüber hinaus könnte ein hoher Prozentsatz an Neutrophilen, die PR3 exprimieren, der bei Vaskulitis-Patienten beobachtet wird, als Risikofaktor für Vaskulitis betrachtet werden. Diese hohe Expression von Membran-PR3 bei Patienten mit GPA führte zu einem Anstieg des ANCA-induzierten respiratorischen Bursts in Neutrophilen, wodurch der Entzündungsprozess verstärkt wurde. In vitro löst die Bindung von ANCA an PR3 den respiratorischen Burst, die Degranulation und die Freisetzung von entzündungsfördernden Zytokinen aus.

Da die PR3-Membranexpression ein wichtiges pathophysiologisches Ereignis bei GPA ist, da sie eine Voraussetzung für die nachfolgende Aktivierung von Neutrophilen durch ANCA ist, versuchten wir, Mechanismen zu bestimmen, die an der PR3-Membranexpression beteiligt sind. Bei Neutrophilen zeigten wir, dass Apoptose eine signifikant erhöhte Membran-PR3-Expression ohne Degranulation auslöste. In diesen Experimenten gelang es uns nicht, MPO an der Membran von Neutrophilen nachzuweisen. Unsere Ergebnisse unterscheiden sich von zuvor berichteten Daten, die zeigen, dass sowohl MPO als auch PR3 während der Apoptose aufgrund der Translokation von azurophilen Granula zur Plasmamembran externalisiert wurden. Dieses Phänomen scheint aufzutreten, wenn Neutrophile einer späten Apoptose und einer sekundären Nekrose unterliegen, was zur Expression aller Körnerproteine ​​auf der Zelloberfläche führt.

Die Apoptose-induzierte PR3-Externalisierung könnte in der Pathophysiologie der GPA von großer Bedeutung sein, da PR3, das ein intrazelluläres Antigen sein sollte, somit an der Plasmamembran apoptotischer Zellen exponiert wird, wodurch sein proinflammatorisches Potenzial, seine immunogenen Eigenschaften und seine Interferenz verstärkt werden mit Makrophagenphagozytose. Wir haben auch gezeigt, dass die PR3-Expression während der Apoptose mit der Expression von Calreticulin, einem wohlbekannten „Eat-me-Signal“, assoziiert ist. Wir haben schließlich bewiesen, dass das Vorhandensein von PR3 die Reprogrammierung von Makrophagen zu einem entzündungshemmenden Profil nach der Phagozytose von apoptotischen Zellen durch den CRT/LRP-Weg beeinträchtigt.

Es kann die Hypothese aufgestellt werden, dass die Expression des Komplexes PR3/Scramblase/CRT und anderer Partner (CD11b, CD16) auf der Oberfläche von apoptotischen Neutrophilen gute Prognosemarker darstellen könnte. Gen-Array-Studien haben auf eine Deregulation von Neutrophilen in GPA hingewiesen. Wir stellen die Hypothese auf, dass das Proteom von Neutrophilen von GPA-Patienten sehr informativ für seinen Aktivierungszustand und Überlebenszustand wäre und dass es ein biologischer Marker für den klinischen Schweregrad sein könnte.

Es ist daher wichtig, die Deregulation von Neutrophilen während ihres gesamten Lebenszyklus zu untersuchen: ihren oxidativen Ausbruch unter Aktivierung, ihre physiologische Apoptose, die Expression von PR3-Partnern. Diese Studie wird an Neutrophilen von Patienten mit GPA im Vergleich zu alters- und geschlechtsangepassten gesunden Kontrollen durchgeführt.

C. Vorstudien Analyse der Apoptose in Neutrophilen von GPA-Patienten In der Literatur wurde festgestellt, dass Neutrophile von Patienten mit ANCA-assoziierter Vaskulitis (AAV) eine gestörte TNFα-induzierte Apoptose aufweisen und tendenziell eine höhere Apoptoserate aufweisen als Kontrollen. Allerdings sind veröffentlichte Daten zur physiologischen Apoptose, die die spontane Apoptose ist, die Neutrophile ohne exogene Stimuli durchlaufen, widersprüchlich. Wenn fötales Kälberserum in Medium hinzugefügt wird, zeigen Neutrophile von GPA-Patienten eine ähnliche Apoptoserate wie Kontrollen. Wenn das Serum von Patienten verwendet wird, haben Neutrophile von AAV-Patienten in Remission eine höhere Überlebensrate in vivo als Kontrollen, und dieser Unterschied verschwindet, wenn normales Serum verwendet wird. Diese Ergebnisse stimmen mit der Entdeckung überein, dass GPA-Patienten eine hohe PCNA-Expression aufweisen, die mit dem Überleben assoziiert ist. Daher wollen wir die Apoptoserate von Neutrophilen in GPA zum Zeitpunkt der Diagnose, während des Rückfalls und nach der Remission im Vollblut untersuchen. Diese Ergebnisse werden mit alters- und geschlechtsangepassten Kontrollen verglichen. Die Apoptose wird durch die Phosphatidylserin-Externalisierung, gemessen durch Durchflusszytometrie nach Annexin-V-Markierung und 7-AAD-Färbung auf CD15+-Zellen, bewertet. Die PCNA-Expression wird auch in verschiedenen klinischen Stadien untersucht und ein proteomisches Profil von apoptotischen Neutrophilen wird erstellt.

Analyse der Scramblase/Calreticulin-Expression in Neutrophilen von GPA-Patienten In einem Zellmodell (RBL-Zelllinie) haben wir gezeigt, dass die Extinktion von Scramblase durch shRNA mit einer verringerten Expression von Phosphatidylserin während der Apoptose verbunden war und dass die durch PR3-Apoptose induzierte Expression ebenfalls beeinträchtigt war (unveröffentlicht Daten). Wir konnten auch zeigen, dass in vitro Scramblase und PR3 physikalisch interagieren. Während der Apoptose ist PR3 auch mit Calreticulin an der Membran von Neutrophilen assoziiert. Diese Daten legen nahe, dass die Assoziation PR3/Scramblase/Calreticulin ein molekulares Gerüst bildet, das eine funktionelle Plattform darstellt, die Erkennungswege (wie CRT/LRP) zwischen Makrophagen und apoptotischen Neutrophilen stören könnte. Die Expression dieser Partner an der neutrophilen Membran während der Apoptose wird bei Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose und nach Erreichen einer Remission untersucht.

Forschungsdesign und Methoden:

1. Charakterisierung der Apoptose in Neutrophilen von GPA-Patienten Wir werden die Apoptoserate von Neutrophilen in Vollblut bestimmen.

   Methodik:

   Die Forschung wird sowohl an Neutrophilen durchgeführt, die von gesunden Kontrollspendern des französischen Blutinstituts (Etablissement Français du Sang) als auch von Vaskulitis-Patienten aus der Abteilung für Innere Medizin des Cochin-Krankenhauses unter der Leitung von Professor Loïc Guillevin isoliert wurden.

   Apoptose wird "physiologisch" in Vollblut durch Inkubation über Nacht bei 37°C induziert.

   Die Externalisierung von Phosphatidylserin wird durch Durchflusszytometrie nach Annexin-V-Markierung in Verbindung mit 7-AAD-Färbung für CD15+-Zellen gemessen.

   Eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen PCNA wird ebenfalls verwendet, um seine Expression sichtbar zu machen.

2. Analyse von Scramblase, PR3, Calreticulin, AnnexinA1, Expression in apoptotischen Neutrophilen von GPA-Patienten Wir werden die Membranexpression von PR3, CRT, PLSCR, AxA1 in apoptotischen Neutrophilen in den verschiedenen Untergruppen von Neutrophilen bestimmen: nicht apoptotische (AnnexinV-, 7AAD -), früh apoptotische Neutrophile (AnnexinV+, 7AAD-) und spät apoptotische Neutrophile (AnnexinV+, 7AAD+). Diese Bestimmung wird für Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose (in aktivem Zustand; BVAS>3) und bei Remission durchgeführt.

   Methodik

   • Neutrophile werden unter Verwendung von Dextran-Gradient und Ficoll aus Blut isoliert.
   • Die Untersuchung der PR3-, CRT-, PLSCR-, AxA1-Membranexpression wird an isolierten Neutrophilen durch Durchflusszytometrie nach Inkubation über Nacht bei 37 °C mit Bewertung der Apoptose durch Annexin-V-Markierung und 7AAD-Färbung gemessen.

3. Untersuchung des respiratorischen Bursts in Neutrophilen von GPA-Patienten Eine der Hauptfunktionen von Neutrophilen ist die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, wir werden den oxidativen Metabolismus von Neutrophilen aufgrund verschiedener Stimuli bestimmen (f-MLP, opsonisierte Zymosan-Kügelchen durch Komplement, opsonisiertes Zymosan Kügelchen durch IgG, PMA) mit oder ohne vorheriges Priming durch TNFα.

   Methodik:

   Die Exploration des respiratorischen Bursts wird im Vollblut mit einer Chemolumineszenz-Technik (Luminol) durchgeführt. Neutrophile werden durch TNFα geprimt oder ohne Priming stimuliert. Die Burst-Reaktion wird 90 Minuten nach der Stimulation analysiert.

4. Deregulation von neutrophilen Cytokinomen Neutrophile sind in der Lage, eine große Anzahl von Cytokinen (IL-1, TNFα, IL-6, IL-12), Wachstumsfaktoren wie GM-CSF und Chimiokine wie IL-8 zu synthetisieren. Kürzlich wurde gezeigt, dass Neutrophile auch große Produzenten von BAFF (B-Zell-Aktivierungsfaktor) sind und dass die Produktion denen von Monozyten oder dendritischen Zellen überlegen ist, wenn sie durch INF-γ stimuliert werden. In GPA-Serum-BAFF-Spiegeln wurde gezeigt, dass sie höher sind als bei Kontrollen, und kürzlich haben Therapeutika, die auf B-Lymphozyten abzielen, in großen kontrollierten Studien ihre Bedeutung bei AAV bestätigt.

   Methodik:

   Das Serum der Patienten wird gleichzeitig mit den Neutrophilen entnommen. Sie werden mit dem BD™ Cytometric Bead Array (CBA) mit Nachweis von IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF und IL-12p70 analysiert. Neutrophile, die wie in 1) isoliert werden, werden durch INF-γ, LPS und G-CSF stimuliert, um ihre Produktion und Sekretion von BAFF/BlyS, bestimmt durch ELISA, zu analysieren.

5. Deregulierung des Proteoms von Neutrophilen und funktionelle Untersuchung neuer PR3-Partner Gen-Array-Studien haben eine wahrscheinliche Deregulierung von Neutrophilen in AAV gezeigt, in dieser Studie werden wir diese Deregulierung auf Proteinebene untersuchen.

Methodik:

Um das Proteom von GPA-Patienten zu untersuchen, wenn sie aktiv und in Remission sind, im Vergleich zu gesunden Kontrollen, werden wir eine Differentialgelelektrophorese von zytosolischen Proben von Neutrophilen verwenden, die durch Beschallung erhalten wurden. Die Identifizierung von interessierenden Proteinen erfolgt durch Massenspektrometrie MALDI-TOF-TOF. Eine funktionelle Validierung dieser Proteine ​​durch Überexpression oder siRNA-Extinktion wird durchgeführt.