中性粒细胞作为肉芽肿性多血管炎（以前称为韦格纳肉芽肿病）的预后因素 (NeutroVasc)

A - 具体目标 总体目标：该项目旨在在细胞和分子水平上研究 GPA 所涉及的病理生理机制。 研究人员希望将中性粒细胞作为预后因素进行研究，并确定 PR3 的意义，PR3 是炎症消退阶段的主要自身抗原。

研究人员的工作假设是中性粒细胞中 PR3 的结构和功能分析将帮助研究人员阐明其在 GPA 中的作用。 因此，我们的长期目标是更好地了解调节中性粒细胞膜 PR3 表达的机制，以抑制它们的激活，并提出适应 GPA 的新型抗炎治疗策略。

目前的项目：研究人员最近证明，在人类嗜中性粒细胞中，i) PR3 可以在没有脱颗粒的情况下在细胞凋亡过程中在嗜中性粒细胞膜上表达，ii) PR3 是分子支架的成员，包括磷脂加扰酶 1（加扰酶）和细胞凋亡过程中外化的钙网蛋白, iii) 细胞凋亡诱导的 PR3 膜表达在吞噬凋亡的中性粒细胞后损害巨噬细胞重编程-抗原能力。

具体目标是：

1. GPA 患者中性粒细胞凋亡的特征
2. 与健康对照相比，GPA 患者中性粒细胞中 PR3 伙伴（CD16、CD11b、钙网蛋白、磷脂杂乱酶 1）或炎症相关共表达蛋白（AnnexinA1）表达的分析
3. 中性粒细胞中 PR3 新伙伴的鉴定
4. GPA患者中性粒细胞蛋白质组分析

B. 背景和意义 1.1。 简介 GPA 是一种系统性血管炎，主要与抗 PR3 ANCA 相关。 激活的嗜中性粒细胞在血管炎病变中的作用通过它们在血管周围浸润中的存在得到提示，尤其是在肾小球和肺中。

PR3 是一种丝氨酸蛋白酶，首先在中性粒细胞的嗜苯胺青颗粒中描述，该颗粒不应与质膜融合，而是在吞噬病原体后在吞噬溶酶体内释放。 我们首次表明 PR3 的亚细胞定位并不局限于嗜天青颗粒，正如之前认为的那样，而是 PR3 定位于分泌小泡，这是一个高度可动的隔室，从而解释了 PR3 在静息分离表面的存在中性粒细胞。 此外，在血管炎患者中观察到高比例的表达 PR3 的中性粒细胞可被视为血管炎的危险因素。 GPA 患者膜 PR3 的这种高表达导致 ANCA 诱导的中性粒细胞呼吸爆发增加，从而增强炎症过程。 在体外，ANCA 与 PR3 的结合会触发呼吸爆发、脱颗粒和促炎细胞因子的释放。

因为 PR3 膜表达是 GPA 中一个重要的病理生理事件，因为它是 ANCA 随后激活嗜中性粒细胞的先决条件，所以我们试图确定 PR3 膜表达所涉及的机制。 在嗜中性粒细胞中，我们证明细胞凋亡引发膜 PR3 表达显着增加而没有脱颗粒。 在这些实验中，我们未能在中性粒细胞膜上检测到 MPO。 我们的结果与之前报道的数据不同，这些数据显示 MPO 和 PR3 在细胞凋亡过程中由于嗜天青颗粒易位到质膜而外化。 这种现象似乎发生在中性粒细胞经历晚期凋亡和继发性坏死，导致细胞表面表达所有颗粒蛋白时。

细胞凋亡诱导的 PR3 外化可能与 GPA 的病理生理学密切相关，因为 PR3 被认为是细胞内抗原，因此暴露在凋亡细胞的质膜上，从而放大其促炎潜力、免疫原性和干扰与巨噬细胞的吞噬作用。 我们还证明，在细胞凋亡过程中，PR3 表达与钙网蛋白的表达有关，钙网蛋白是众所周知的“吃我信号”。 我们最终证明，在通过 CRT/LRP 途径吞噬凋亡细胞后，PR3 的存在会损害巨噬细胞重新编程为抗炎特性。

可以假设，在凋亡的中性粒细胞表面，复合物 PR3/scramblase/CRT 和其他伙伴（CD11b、CD16）的表达可能构成良好的预后标志物。基因阵列研究指出 GPA 中的中性粒细胞失调。 我们假设 GPA 患者中性粒细胞的蛋白质组可以提供有关其激活状态、存活状态的大量信息，并且它可能是临床严重程度的生物标志物。

因此，研究中性粒细胞在其整个生命周期中的失调是相关的：它们在激活下的氧化爆发、它们的生理性细胞凋亡、PR3 伙伴的表达。 这项研究将在 GPA 患者的嗜中性粒细胞中进行，并与年龄和性别调整后的健康对照进行比较。

C. 初步研究 GPA 患者嗜中性粒细胞凋亡分析 在文献中，发现来自 ANCA 相关血管炎 (AAV) 患者的嗜中性粒细胞具有受干扰的 TNFα 诱导的凋亡，并且倾向于具有比对照更高的凋亡率。 然而，关于生理性细胞凋亡的已发表数据是矛盾的，生理性细胞凋亡是嗜中性粒细胞在没有外源性刺激的情况下发生的自发性细胞凋亡。 当在培养基中加入小牛胎血清时，GPA 患者的中性粒细胞显示出与对照组相似的凋亡率。 当使用患者血清时，缓解期 AAV 患者的中性粒细胞体内存活率高于对照组，而当使用正常血清时，这种差异消失。 这些结果与 GPA 患者具有与生存相关的 PCNA 高表达的发现一致。 因此，我们想研究全血诊断、复发期间和缓解后 GPA 中中性粒细胞的凋亡率。 这些结果将与年龄和性别匹配的对照进行比较。 在 CD15+ 细胞上膜联蛋白-V 标记和 7-AAD 染色后，通过流式细胞术测量的磷脂酰丝氨酸外化来评估细胞凋亡。 PCNA 表达也将在不同的临床阶段进行研究，并将进行凋亡嗜中性粒细胞的蛋白质组学分析。

GPA 患者中性粒细胞中 scramblase/钙网蛋白表达的分析 在细胞模型（RBL 细胞系）中，我们已经证明 shRNA 引起的 scramblase 消退与细胞凋亡过程中磷脂酰丝氨酸的表达降低有关，并且 PR3 凋亡诱导的表达也受损（未发表）数据）。 我们还能够证明体外 scramblase 和 PR3 物理相互作用。 在细胞凋亡过程中，PR3 还与中性粒细胞膜上的钙网蛋白相关。 这些数据表明 PR3/Scramblase/Calreticulin 的结合形成了一个分子支架，它是一个功能平台，可以干扰巨噬细胞和凋亡中性粒细胞之间的识别途径（如 CRT/LRP）。 这些伴侣在细胞凋亡过程中在嗜中性粒细胞膜上的表达将在诊断时和获得缓解时对患者进行研究。

研究设计和方法：

1. GPA 患者嗜中性粒细胞凋亡的表征我们将测定全血中嗜中性粒细胞的凋亡率。

   方法：

   研究将对从法国血液研究所 (Etablissement Français du Sang) 获得的健康对照供体和从 Loïc Guillevin 教授领导的科钦医院内科的血管炎患者分离的嗜中性粒细胞进行研究。

   通过在 37°C 下过夜孵育，将在全血中“生理上”诱导细胞凋亡。

   在膜联蛋白-V 标记与 CD15+ 细胞的 7-AAD 染色相关后，将通过流式细胞术测量磷脂酰丝氨酸外化。

   使用针对 PCNA 的特异性抗体的蛋白质印迹分析也将用于可视化其表达。

2. GPA 患者凋亡中性粒细胞中 scramblase、PR3、钙网蛋白、AnnexinA1 表达的分析我们将确定 PR3、CRT、PLSCR、AxA1 在中性粒细胞不同亚群中凋亡中性粒细胞的膜表达：非凋亡亚型（AnnexinV-，7AAD） -), 早期凋亡中性粒细胞 (AnnexinV+, 7AAD-) 和晚期凋亡中性粒细胞 (AnnexinV+, 7AAD+)。 将在诊断时（处于活动状态；BVAS>3）和缓解时对患者进行此确定。

   方法

   • 使用葡聚糖梯度和 Ficoll 从血液中分离嗜中性粒细胞。
   • PR3、CRT、PLSCR、AxA1、膜表达的研究将在 37°C 过夜孵育后通过流式细胞术测量分离的中性粒细胞的膜表达，并通过膜联蛋白-V 标记和 7AAD 染色评估细胞凋亡。

3. GPA患者中性粒细胞呼吸爆发的研究 中性粒细胞的主要功能之一是产生活性氧，我们将测定中性粒细胞在不同刺激（f-MLP、补体调理酵母聚糖珠、调理酵母聚糖）下的氧化代谢由 IgG、PMA 制成的珠子），有或没有预先通过 TNFα 引发。

   方法：

   将使用化学发光（鲁米诺）技术在全血中探索呼吸爆发。 中性粒细胞将被 TNFα 引发或在没有引发的情况下受到刺激。 将在刺激后 90 分钟内分析突发反应。

4. 中性粒细胞细胞因子组失调 中性粒细胞能够合成大量细胞因子（IL-1、TNFα、IL-6、IL-12）、GM-CSF 等生长因子和 IL-8 等嵌合因子。 最近表明，中性粒细胞也是 BAFF（B 细胞激活因子）的重要生产者，并且当受到 INF-γ 刺激时，其生产优于单核细胞或树突细胞。 在 GPA 中，血清 BAFF 水平已显示高于对照，最近靶向 B 淋巴细胞的疗法已在大型对照试验中证实了它们在 AAV 中的重要性。

   方法：

   患者血清与中性粒细胞同时采集。 它们将使用 BD™ Cytometric Bead Array (CBA) 进行分析，并检测 IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF 和 IL-12p70。 如 1) 中分离的中性粒细胞将受到 INF-γ、LPS 和 G-CSF 的刺激，以分析其通过 ELISA 测定的 BAFF/BlyS 的产生和分泌。

5. 嗜中性粒细胞蛋白质组失调和新 PR3 伙伴的功能研究 基因阵列研究表明 AAV 中嗜中性粒细胞可能失调，在本研究中，我们将在蛋白质水平研究这种失调。

方法：

为了研究 GPA 患者在活动和缓解时与健康对照相比的蛋白质组，我们将使用通过超声处理获得的嗜中性粒细胞胞质样品的凝胶电泳差异。 感兴趣的蛋白质的鉴定将通过质谱法 MALDI-TOF-TOF 完成。 将通过过表达或 siRNA 消退对这些蛋白质进行功能验证。