Neutrofily jako prognostické faktory u granulomatózy s polyangiitidou (dříve nazývaná Wegenerova granulomatóza) (NeutroVasc)

A - Specifické cíle Obecný cíl: Tento projekt je určen ke studiu fyziopatologických mechanismů zapojených do GPA na buněčné a molekulární úrovni. výzkumníci chtějí studovat neutrofily jako prognostické faktory a určit implikaci PR3, hlavního autoantigenu ve fázi vymizení zánětu.

pracovní hypotéza výzkumníků je, že strukturální a funkční analýza PR3 v neutrofilech pomůže výzkumníkům odhalit jeho roli v GPA. Naším dlouhodobým cílem je tedy lépe porozumět mechanismům zapojeným do modulace exprese PR3 na membráně neutrofilů za účelem inhibice jejich aktivace a navrhnout nové protizánětlivé terapeutické strategie přizpůsobené GPA.

Současný projekt: Výzkumníci nedávno prokázali, že v lidských neutrofilech i) může být PR3 exprimován na membráně neutrofilů během apoptózy v nepřítomnosti degranulace, ii) PR3 je členem molekulárního skeletu obsahujícího fosfolipidscramblase1 (scramblase) a kalretikulin externalizovaný během apoptózy , iii) apoptózou indukovaná membránová exprese PR3 narušuje přeprogramování makrofágů po fagocytóze apoptotických neutrofilů Hypotézou výzkumníků je, že PR3 může mít specifické molekulární partnery, kteří mohou usnadnit jeho externalizaci a/nebo jeho přetrvávání na plazmatické membráně během apoptózy neutrofilů, a tím potencovat jeho auto -antigenní kapacita.

Konkrétní cíle jsou:

1. Charakterizace apoptózy v neutrofilech od pacientů s GPA
2. Analýza partnerů PR3 (CD16, CD11b, Calreticulin, Fosfolipidscramblase1) nebo koexprimovaného zájmového proteinu při expresi zánětu (AnnexinA1,) v neutrofilech od pacientů s GPA ve srovnání se zdravými kontrolami
3. Identifikace nových partnerů PR3 v neutrofilech
4. Analýza proteomu neutrofilů od pacientů s GPA

B. Pozadí a význam 1.1. Úvod GPA je systémová vaskulitida, která je spojena hlavně s anti-PR3 ANCA. Role aktivovaných neutrofilů v lézích vaskulitidy je naznačena jejich přítomností v perivaskulárních infiltrátech, zejména v ledvinových glomerulech a v plicích.

PR3 je serinová proteáza poprvé popsaná v azurofilních granulích neutrofilů, u kterých se NESMÍ fúzovat s plazmatickou membránou, ale jsou uvolňovány ve fagolyzozomu po fagocytóze patogenu. Poprvé jsme ukázali, že subcelulární lokalizace PR3 nebyla omezena na azurofilní granule, jak se dříve myslelo, ale že PR3 byl lokalizován v sekrečních vezikulách, vysoce mobilizovatelném kompartmentu, což vysvětluje přítomnost PR3 na povrchu klidové izolované neutrofily. Navíc vysoké procento neutrofilů exprimujících PR3 pozorované u pacientů s vaskulitidou by mohlo být považováno za rizikový faktor vaskulitidy. Tato vysoká exprese membránového PR3 u pacientů s GPA vedla ke zvýšení ANCA-indukovaného respiračního vzplanutí v neutrofilech, čímž se zvýšil zánětlivý proces. In vitro vazba ANCA na PR3 spouští respirační vzplanutí, degranulaci a uvolňování prozánětlivých cytokinů.

Protože exprese membrány PR3 je důležitou patofyziologickou událostí v GPA, protože je předpokladem pro následnou aktivaci neutrofilů pomocí ANCA, snažili jsme se určit mechanismy zapojené do exprese membrány PR3. U neutrofilů jsme prokázali, že apoptóza spustila významně zvýšenou membránovou expresi PR3 bez degranulace. V těchto experimentech se nám nepodařilo detekovat MPO na membráně neutrofilů. Naše výsledky se liší od dříve publikovaných údajů, které ukazují, že jak MPO, tak PR3 byly externalizovány během apoptózy kvůli translokaci azurofilních granulí na plazmatickou membránu. Zdá se, že k tomuto jevu dochází, když neutrofily procházejí pozdní apoptózou a sekundární nekrózou, což vede k expresi všech granulárních proteinů na buněčném povrchu.

Apoptózou indukovaná externalizace PR3 by mohla mít velký význam v patofyziologii GPA, protože PR3, který měl být intracelulárním antigenem, je tedy exponován na plazmatické membráně apoptotických buněk, čímž se zesiluje jeho prozánětlivý potenciál, jeho imunogenní vlastnosti a interferuje s fagocytózou makrofágů. Také jsme prokázali, že během apoptózy je exprese PR3 spojena s expresí calreticulinu, dobře známého „signálu sněz mě“. Konečně jsme prokázali, že přítomnost PR3 zhoršuje přeprogramování makrofágů na protizánětlivý profil po fagocytóze apoptotických buněk cestou CRT/LRP.

Lze předpokládat, že exprese komplexu PR3/scramblase/CRT a dalších partnerů (CD11b, CD16) na povrchu apoptotických neutrofilů by mohla představovat dobré markery prognózy. Studie genového pole poukázaly na deregulaci neutrofilů v GPA. Vytváříme hypotézu, že proteom neutrofilů pacientů s GPA by byl velmi informativní o jeho aktivačním stavu, stavu přežití a že by mohl být biologickým markerem klinické závažnosti.

Je tedy vhodné studovat deregulaci neutrofilů během celého jejich životního cyklu: jejich oxidační vzplanutí při aktivaci, jejich fyziologickou apoptózu, expresi PR3 partnerů. Tato studie bude provedena na neutrofilech od pacientů s GPA ve srovnání se zdravými kontrolami upravenými podle věku a pohlaví.

C. Předběžné studie Analýza apoptózy u neutrofilů od pacientů s GPA V literatuře bylo zjištěno, že neutrofily pacientů s vaskulitidou spojenou s ANCA (AAV) mají narušenou apoptózu indukovanou TNFa a mají tendenci mít vyšší míru apoptózy než kontroly. Publikované údaje o fyziologické apoptóze, což je spontánní apoptóza, kterou neutrofily podstupují v nepřítomnosti exogenních stimulů, jsou však rozporuplné. Když se do média přidá telecí fetální sérum, neutrofily od pacientů s GPA vykazují podobnou míru apoptózy než kontroly. Když se použije sérum pacientů, neutrofily od pacientů s AAV v remisi mají vyšší míru přežití in vivo než kontroly a tento rozdíl zmizí, když se použije normální sérum. Tyto výsledky jsou v souladu s objevem, že pacienti s GPA mají vysokou expresi PCNA, která je spojena s přežitím. Proto chceme studovat míru apoptózy neutrofilů v GPA při diagnóze, během relapsu a po remisi na plné krvi. Tyto výsledky budou porovnány s kontrolami odpovídající věku a pohlaví. Apoptóza bude hodnocena externalizací fosfatidylserinu měřenou průtokovou cytometrií po značení annexinem-V a barvením 7-AAD na buňkách CD15+. Exprese PCNA bude také zkoumána v různém klinickém stadiu a bude proveden proteomický profil apoptotických neutrofilů.

Analýza exprese skramblasy/kalretikulinu v neutrofilech od pacientů s GPA Na buněčném modelu (buněčná linie RBL) jsme prokázali, že extinkce skramblasy pomocí shRNA byla spojena se sníženou expresí fosfatidylserinu během apoptózy a že exprese indukovaná apoptózou PR3 byla také narušena (nepublikováno data). Podařilo se nám také prokázat, že in vitro scramblase a PR3 fyzicky interagují. Během apoptózy je PR3 také spojen s kalretikulinem na membráně neutrofilů. Tato data naznačují, že spojení PR3/Scramblase/Calreticulin tvoří molekulární skafold, který je funkční platformou, která by mohla interferovat s rozpoznávacími cestami (jako CRT/LRP) mezi makrofágy a apoptotickými neutrofily. Exprese těchto partnerů na membráně neutrofilů během apoptózy bude zkoumána u pacientů při diagnóze a při dosažení remise.

Design a metody výzkumu:

1. Charakterizace apoptózy u neutrofilů od pacientů s GPA Stanovíme míru apoptózy neutrofilů v plné krvi.

   Metodologie:

   Výzkum bude proveden jak na neutrofilech izolovaných od zdravých kontrolních dárců získaných ve Francouzském krevním institutu (Etablissement Français du Sang), tak na pacientech s vaskulitidou z oddělení interního lékařství nemocnice Cochin vedené profesorem Loïcem Guillevinem.

   Apoptóza bude indukována "fyziologicky" v plné krvi inkubací přes noc při 37 °C.

   Externalizace fosfatidylserinu bude měřena průtokovou cytometrií po značení annexinem-V spojeném s 7-AAD barvením pro CD15+ buňky.

   K vizualizaci její exprese bude také použita analýza Western blot s použitím specifické protilátky proti PCNA.

2. Analýza scramblasy, PR3, kalretikulinu, AnnexinA1, exprese v apoptotických neutrofilech od pacientů s GPA Stanovíme membránovou expresi PR3, CRT, PLSCR, AxA1 v apoptotických neutrofilech v různých podskupinách neutrofilů: neapoptotických (AnnexinV-, 7AAD -), časné apoptotické neutrofily (AnnexinV+, 7AAD-) a pozdní apoptotické neutrofily (AnnexinV+, 7AAD+). Toto stanovení bude provedeno u pacientů v době diagnózy (v aktivním stavu; BVAS>3) a v době remise.

   Metodologie

   • Neutrofily budou izolovány z krve pomocí gradientu Dextran a Ficoll.
   • Zkoumání exprese PR3, CRT, PLSCR, AxA1, membrány bude měřeno na izolovaných neutrofilech průtokovou cytometrií po inkubaci přes noc při 37 °C s hodnocením apoptózy značením annexinem-V a barvením 7AAD.

3. Studium respiračního vzplanutí u neutrofilů pacientů s GPA Jednou z hlavních funkcí neutrofilů je produkce reaktivních forem kyslíku, budeme stanovovat oxidační metabolismus neutrofilů vlivem různých stimulů (f-MLP, opsonizované zymosanové kuličky komplementem, opsonizovaný zymosan kuličky IgG, PMA) s nebo bez předchozí aktivace TNFa.

   Metodologie:

   Zkoumání respiračního vzplanutí bude provedeno v plné krvi chemoluminiscenční (luminolovou) technikou. Neutrofily budou aktivované TNFα nebo stimulovány bez aktivace. Odezva burst bude analyzována během 90 minut po stimulaci.

4. Deregulace cytokinomu neutrofilů Neutrofily jsou schopny syntetizovat velké množství cytokinů (IL-1, TNFα, IL-6, IL-12), růstových faktorů jako GM-CSF a chimiokinů jako IL-8. Nedávno se ukázalo, že neutrofily jsou také velkými producenty BAFF (B-cell activating factor) a že produkce je lepší než produkce monocytů nebo dendritických buněk, když jsou stimulovány INF-y. V séru GPA se ukázalo, že hladiny BAFF jsou vyšší než u kontrol a nedávno cílená terapeutika na B-lymfocyty potvrdila ve velkých kontrolovaných studiích jejich význam u AAV.

   Metodologie:

   Sérum pacientů bude odebíráno ve stejnou dobu jako neutrofily. Budou analyzovány pomocí BD™ Cytometric Bead Array (CBA) s detekcí IL-8, IL-lp, IL-6, IL-10, TNF a IL-12p70. Neutrofily, které budou izolovány jako v 1) budou stimulovány INF-γ, LPS a G-CSF k analýze jejich produkce a sekrece BAFF/BlyS stanovené pomocí ELISA.

5. Deregulace neutrofilního proteomu a funkční studie nových partnerů PR3 Studie genového pole prokázaly pravděpodobnou deregulaci neutrofilů v AAV, v této studii budeme studovat tuto deregulaci na úrovni proteinů.

Metodologie:

Ke studiu proteomu pacienta s GPA, když je aktivní a v remisi ve srovnání se zdravými kontrolami, použijeme rozdíl v gelové elektroforéze cytosolických vzorků neutrofilů získaných sonikací. Identifikace sledovaných proteinů bude provedena hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF-TOF. Bude provedena funkční validace těchto proteinů nadměrnou expresí nebo extinkcí siRNA.