Neutrofiler som prognostiske faktorer ved granulomatose med polyangiitis (tidligere kaldet Wegeners granulomatose) (NeutroVasc)

A - Specifikke mål Generelt formål: Dette projekt er designet til at studere fysiopatologiske mekanismer involveret i GPA på cellulært og molekylært niveau. efterforskerne ønsker at studere neutrofiler som prognostiske faktorer og bestemme implikationen af ​​PR3, det vigtigste autoantigen i opløsningsfasen af ​​inflammation.

efterforskernes arbejdshypotese er, at strukturel og funktionel analyse af PR3 i neutrofiler vil hjælpe efterforskerne med at afdække dens rolle i GPA. Derfor er vores langsigtede mål at bedre forstå mekanismerne involveret i moduleringen af ​​PR3-ekspression ved membranen af ​​neutrofiler for at hæmme deres aktivering og foreslå nye anti-inflammatoriske terapeutiske strategier tilpasset GPA.

Nuværende projekt: Forskerne har for nylig demonstreret, at i humane neutrofiler kan i) PR3 udtrykkes ved neutrofilernes membran under apoptose i fravær af degranulering, ii) PR3 er et medlem af et molekylært stillads, der omfatter phospholipidscramblase1 (scramblase) og calreticuliniseret eksternalisering. , iii) apoptose-induceret PR3-membranekspression svækker makrofag-omprogrammering efter fagocytose af apoptotiske neutrofiler. Efterforskernes hypotese er, at PR3 kan have specifikke molekylære partnere, som kan lette dets eksternalisering og/eller dets persistens ved plasmamembranen under neutrofil apoptose og dermed potentiere dens auto -antigen kapacitet.

De specifikke mål er:

1. Karakterisering af apoptose i neutrofiler fra GPA-patienter
2. Analyse af PR3-partnere (CD16, CD11b, Calreticulin, Phospholipidscramblase1) eller co-udtrykt protein af interesse i inflammation (AnnexinA1,) ekspression i neutrofiler fra patienter med GPA sammenlignet med raske kontroller
3. Identifikation af nye partnere til PR3 i neutrofiler
4. Analyse af proteomet af neutrofiler fra GPA-patienter

B. Baggrund og betydning 1.1. Introduktion GPA er en systemisk vaskulitis, som hovedsageligt er forbundet med anti-PR3 ANCA. Rollen af ​​aktiverede neutrofiler i vaskulitislæsioner antydes af deres tilstedeværelse i perivaskulære infiltrater, især i nyrer glomeruli og i lungerne.

PR3 er en serinprotease, der først blev beskrevet i azurofile granuler af neutrofiler, som IKKE skal fusionere med plasmamembranen, men frigives i fagolysosomet efter fagocytose af patogenet. Vi har for første gang vist, at den subcellulære lokalisering af PR3 ikke var begrænset til azurofile granula, som tidligere antaget, men at PR3 var lokaliseret i sekretoriske vesikler, et meget mobiliserbart rum, hvilket forklarer tilstedeværelsen af ​​PR3 på overfladen af ​​hvilende isolerede neutrofiler. Desuden kunne en høj procentdel af neutrofiler, der udtrykker PR3 observeret hos vaskulitispatienter, betragtes som en risikofaktor for vaskulitis. Denne høje ekspression af membran PR3 hos patienter med GPA resulterede i en stigning i ANCA-induceret respiratorisk udbrud i neutrofiler, hvilket forstærkede den inflammatoriske proces. In vitro udløser bindingen af ​​ANCA til PR3 respiratorisk udbrud, degranulering og frigivelse af pro-inflammatoriske cytokiner.

Fordi PR3-membranekspression er en vigtig patofysiologisk begivenhed i GPA, da det er en forudsætning for den efterfølgende aktivering af neutrofiler af ANCA, søgte vi at bestemme mekanismer involveret i PR3-membranekspression. I neutrofiler viste vi, at apoptose udløste en signifikant øget membran PR3-ekspression uden degranulering. I disse eksperimenter lykkedes det os ikke at detektere MPO ved membranen af ​​neutrofiler. Vores resultater adskiller sig fra tidligere rapporterede data, der viser, at både MPO og PR3 blev eksternaliseret under apoptose på grund af translokationen af ​​azurofile granuler til plasmamembranen. Dette fænomen synes at forekomme, når neutrofiler gennemgår sen apoptose og sekundær nekrose, hvilket fører til ekspression af alle granulatproteiner på celleoverfladen.

Apoptose-induceret PR3 eksternalisering kunne være af stor relevans i patofysiologien af ​​GPA, fordi PR3, som skulle være et intracellulært antigen, således eksponeres ved plasmamembranen af ​​apoptotiske celler, hvilket forstærker dets pro-inflammatoriske potentiale, dets immunogene egenskaber og interfererer. med makrofagfagocytose. Vi har også vist, at PR3-ekspression under apoptose er forbundet med ekspressionen af ​​calreticulin, et velkendt "spis-mig-signal". Vi har endelig bevist, at tilstedeværelsen af ​​PR3 hæmmer omprogrammeringen af ​​makrofag til en anti-inflammatorisk profil efter fagocytose af apoptotiske celler gennem CRT/LRP-vejen.

Det kan antages, at ekspressionen af ​​det komplekse PR3/scramblase/CRT og andre partnere (CD11b, CD16) på overfladen af ​​apoptotiske neutrofiler kunne udgøre gode prognosemarkører. Genarray-undersøgelser har påpeget en deregulering af neutrofiler i GPA. Vi fremsætter den hypotese, at proteomet af neutrofiler fra GPA-patienter ville være meget informativt om dets aktiveringstilstand, overlevelsestilstand, og at det kunne være en biologisk markør for klinisk sværhedsgrad.

Det er derfor relevant at studere dereguleringen af ​​neutrofiler under hele deres livscyklus: deres oxidative udbrud under aktivering, deres fysiologiske apoptose, udtryk for PR3-partnere. Denne undersøgelse vil blive udført i neutrofiler fra patienter med GPA sammenlignet med alders- og kønsjusterede raske kontroller.

C. Indledende undersøgelser Analyse af apoptose i neutrofiler fra GPA-patienter I litteraturen blev neutrofiler fra patienter med ANCA-associeret vasculitis (AAV) fundet at have en forstyrret TNFa-induceret apoptose og har en tendens til at have en højere apoptoserate end kontroller. Imidlertid er offentliggjorte data om fysiologisk apoptose, som er den spontane apoptose, som neutrofiler gennemgår i fravær af eksogene stimuli, modstridende. Når kalvefosterserum tilsættes i medium, udviser neutrofiler fra GPA-patienter en lignende apoptoserate som kontroller. Når serum fra patienter anvendes, har neutrofiler fra AAV-patienter i remission en højere overlevelsesrate in vivo end kontroller, og denne forskel forsvinder, når der anvendes normalt serum. Disse resultater er i overensstemmelse med opdagelsen af, at GPA-patienter har et højt udtryk for PCNA, som er forbundet med overlevelse. Derfor ønsker vi at studere apoptosehastigheden af ​​neutrofiler i GPA ved diagnose, under tilbagefald og efter remission på fuldblod. Disse resultater vil blive sammenlignet med alder og køn matchede kontroller. Apoptose vil blive evalueret ved phosphatidylserin-eksterniseringen målt ved flowcytometri efter annexin-V-mærkning og 7-AAD-farvning på CD15+-celler. PCNA-ekspression vil også blive undersøgt på de forskellige kliniske stadier, og proteomisk profil af apoptotiske neutrofiler vil blive udført.

Analyse af scramblase/calreticulin-ekspression i neutrofiler fra GPA-patienter I en cellulær model (RBL-cellelinje) har vi vist, at scramblase-udryddelse med shRNA var forbundet med en nedsat ekspression af phosphatidylserin under apoptose, og at PR3-apoptose-induceret ekspression også var svækket (upubliceret) data). Vi var også i stand til at demonstrere, at in vitro scramblase og PR3 fysisk interagerer. Under apoptose er PR3 også forbundet med calreticulin ved membranen af ​​neutrofiler. Disse data tyder på, at associationen PR3/Scramblase/Calreticulin danner et molekylært stillads, som er en funktionel platform, som kan interferere med genkendelsesveje (som CRT/LRP) mellem makrofager og apoptotiske neutrofiler. Ekspressionen af ​​disse partnere ved den neutrofile membran under apoptose vil blive undersøgt hos patienter ved diagnose og når remission opnås.

Forskningsdesign og metoder:

1. Karakterisering af apoptose hos neutrofiler fra GPA-patienter Vi vil bestemme apoptosefrekvensen for neutrofiler i fuldblod.

   Metode:

   Forskning vil blive udført både på neutrofiler isoleret fra raske kontroldonorer opnået i det franske blodinstitut (Etablissement Français du Sang) og fra vaskulitispatienter fra afdelingen for intern medicin på Cochin Hospital under ledelse af professor Loïc Guillevin.

   Apoptose vil blive induceret "fysiologisk" i fuldblod ved inkubation natten over ved 37°C.

   Phosphatidylserin-eksternisering vil blive målt ved flowcytometri efter annexin-V-mærkning forbundet med 7-AAD-farvning for CD15+-celler.

   Western blot-analyse under anvendelse af et specifikt antistof mod PCNA vil også blive brugt til at visualisere dets ekspression.

2. Analyse af scramblase, PR3, calreticulin, AnnexinA1, ekspression i apoptotiske neutrofiler fra GPA-patienter Vi vil bestemme membranekspressionen af ​​PR3, CRT, PLSCR, AxA1, i apoptotiske neutrofiler i de forskellige undergrupper af neutrofiler: ikke-apoptotiske (AnnexinV-, 7AAD) -), tidlige apoptotiske neutrofiler (AnnexinV+, 7AAD-) og sene apoptotiske neutrofiler (AnnexinV+, 7AAD+). Denne bestemmelse vil blive foretaget for patienter på tidspunktet for diagnosen (i aktiv tilstand; BVAS>3) og ved remission.

   Metodik

   • Neutrofiler vil blive isoleret fra blod ved hjælp af Dextran gradient og Ficoll.
   • Undersøgelse af PR3, CRT, PLSCR, AxA1, membranekspression vil blive målt på isolerede neutrofiler ved flowcytometri efter inkubation natten over ved 37°C med vurdering af apoptose ved annexin-V-mærkning og 7AAD-farvning.

3. Undersøgelse af respiratorisk udbrud i neutrofiler hos GPA-patienter En af neutrofilernes hovedfunktioner er produktionen af ​​reaktive oxygenarter, vi vil bestemme den oxidative metabolisme af neutrofiler på grund af forskellige stimuli (f-MLP, opsoniserede zymosan-perler ved komplement, opsoniseret zymosan perler af IgG, PMA) med eller uden en tidligere priming med TNFa.

   Metode:

   Udforskning af respiratorisk udbrud vil blive udført i fuldblod med en kemoluminescerende (luminol) teknik. Neutrofiler vil blive primet af TNFa eller stimuleret uden priming. Burst-responsen vil blive analyseret i løbet af 90 minutter efter stimulering.

4. Deregulering af neutrofile Cytokinom Neutrofiler er i stand til at syntetisere et stort antal cytokiner (IL-1, TNFα, IL-6, IL-12), vækstfaktorer som GM-CSF og chimiokiner som IL-8. For nylig er det blevet vist, at neutrofiler også er gode producenter af BAFF (B-celleaktiverende faktor), og at produktionen er overlegen i forhold til monocytter eller dendritiske celler, når de stimuleres af INF-y. I GPA-serum har BAFF-niveauer vist sig at være højere end kontroller, og for nylig rettet mod B-lymfocytter har terapeutika i store kontrollerede forsøg bekræftet deres betydning i AAV.

   Metode:

   Serum fra patienter vil blive opsamlet på samme tid som neutrofiler. De vil blive analyseret ved hjælp af BD™ Cytometric Bead Array (CBA) med påvisning af IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF og IL-12p70. Neutrofiler, som vil blive isoleret som i 1) vil blive stimuleret af INF-y, LPS og G-CSF til at analysere deres produktion og sekretion af BAFF/BlyS bestemt ved ELISA.

5. Deregulering af neutrofil Proteom og funktionel undersøgelse af nye PR3-partnere Genarray-studier har vist en sandsynlig deregulering af neutrofiler i AAV, i denne undersøgelse vil vi studere denne deregulering på proteinniveau.

Metode:

For at studere proteomet af GPA-patient, når det er aktivt og i remission sammenlignet med raske kontroller, vil vi bruge en differential i gelelektroforese af cytosoliske prøver af neutrofiler opnået ved sonikering. Identifikation af proteiner af interesse vil blive udført ved massespektrometri MALDI-TOF-TOF. Funktionel validering af disse proteiner ved overekspression eller siRNA-udryddelse vil blive udført.