Nøytrofiler som prognostiske faktorer ved granulomatose med polyangiitt (tidligere kalt Wegeners granulomatose) (NeutroVasc)

A - Spesifikke mål Generelt mål: Dette prosjektet er designet for å studere fysiopatologiske mekanismer involvert i GPA på cellulært og molekylært nivå. etterforskerne ønsker å studere nøytrofiler som prognostiske faktorer og bestemme implikasjonen av PR3, det viktigste autoantigenet i oppløsningsfasen av betennelse.

etterforskernes arbeidshypotese er at strukturell og funksjonell analyse av PR3 i nøytrofiler vil hjelpe etterforskerne til å avdekke dens rolle i GPA. Derfor er vårt langsiktige mål å bedre forstå mekanismene involvert i moduleringen av PR3-ekspresjon ved membranen til nøytrofiler for å hemme deres aktivering og foreslå nye antiinflammatoriske terapeutiske strategier tilpasset GPA.

Nåværende prosjekt: Forskerne demonstrerte nylig at i humane nøytrofiler i) PR3 kan uttrykkes ved membranen til nøytrofiler under apoptose i fravær av degranulering, ii) PR3 er et medlem av et molekylært stillas som omfatter fosfolipidscramblase1 (scramblase) og calreticulin eksternalisert , iii) apoptose-indusert PR3-membranekspresjon svekker makrofag-reprogrammering etter fagocytose av apoptotiske nøytrofiler. Etterforskernes hypotese er at PR3 kan ha spesifikke molekylære partnere som kan lette dens eksternalisering og/eller dens utholdenhet ved plasmamembranen under nøytrofil apoptose og dermed potensiere dens auto -antigen kapasitet.

De spesifikke målene er:

1. Karakterisering av apoptose i nøytrofiler fra GPA-pasienter
2. Analyse av PR3-partnere (CD16, CD11b, Calreticulin, Phospholipidscramblase1) eller co-uttrykt protein av interesse i inflammasjon (AnnexinA1,) uttrykk i nøytrofiler fra pasienter med GPA sammenlignet med friske kontroller
3. Identifikasjon av nye partnere til PR3 i nøytrofiler
4. Analyse av proteomet til nøytrofiler fra GPA-pasienter

B. Bakgrunn og betydning 1.1. Introduksjon GPA er en systemisk vaskulitt som hovedsakelig er assosiert med anti-PR3 ANCA. Rollen til aktiverte nøytrofiler i vaskulittlesjoner antydes av deres tilstedeværelse i perivaskulære infiltrater, spesielt i nyreglomeruli og i lungene.

PR3 er en serinprotease som først ble beskrevet i azurofile granuler av nøytrofiler som IKKE skal smelte sammen med plasmamembranen, men frigjøres i fagolysosomet etter fagocytose av patogenet. Vi har vist for første gang at den subcellulære lokaliseringen av PR3 ikke var begrenset til azurofile granuler, som tidligere antatt, men at PR3 var lokalisert i sekretoriske vesikler, et svært mobiliserbart rom, og forklarer dermed tilstedeværelsen av PR3 på overflaten av hvilende isolerte nøytrofiler. Dessuten kan en høy prosentandel av nøytrofiler som uttrykker PR3 observert hos vaskulittpasienter betraktes som en risikofaktor for vaskulitt. Dette høye uttrykket av membran PR3 hos pasienter med GPA resulterte i en økning i ANCA-indusert respirasjonsutbrudd i nøytrofiler og forsterket dermed den inflammatoriske prosessen. In vitro utløser bindingen av ANCA til PR3 respirasjonsutbrudd, degranulering og frigjøring av pro-inflammatoriske cytokiner.

Fordi PR3-membranuttrykk er en viktig patofysiologisk hendelse i GPA siden det er en forutsetning for påfølgende aktivering av nøytrofiler av ANCA, forsøkte vi å bestemme mekanismer involvert i PR3-membranuttrykk. Hos nøytrofiler demonstrerte vi at apoptose utløste et betydelig økt PR3-uttrykk uten degranulering. I disse eksperimentene klarte vi ikke å oppdage MPO ved membranen til nøytrofiler. Resultatene våre skiller seg fra tidligere rapporterte data som viser at både MPO og PR3 ble eksternalisert under apoptose på grunn av translokasjonen av azurofile granuler til plasmamembranen. Dette fenomenet ser ut til å oppstå når nøytrofiler gjennomgår sen apoptose og sekundær nekrose, noe som fører til ekspresjon av alle granulatproteiner på celleoverflaten.

Apoptose-indusert PR3 eksternalisering kan være av stor relevans i patofysiologien til GPA fordi PR3, som skulle være et intracellulært antigen, således eksponeres ved plasmamembranen til apoptotiske celler og forsterker dermed dets pro-inflammatoriske potensial, dets immunogene egenskaper og forstyrrer med makrofagfagocytose. Vi har også vist at PR3-ekspresjon under apoptose er assosiert med uttrykket av calreticulin, et velkjent "spis-meg-signal". Vi har endelig vist at tilstedeværelsen av PR3 svekker omprogrammeringen av makrofag til en anti-inflammatorisk profil etter fagocytose av apoptotiske celler gjennom CRT/LRP-veien.

Det kan antas at ekspresjonen av komplekset PR3/scramblase/CRT og andre partnere (CD11b, CD16) på overflaten av apoptotiske nøytrofiler kan utgjøre gode prognosemarkører. Genarraystudier har påpekt en deregulering av nøytrofiler i GPA. Vi legger hypotesen om at proteomet til nøytrofiler til GPA-pasienter vil være veldig informativt om aktiveringstilstanden, overlevelsestilstanden og at det kan være en biologisk markør for klinisk alvorlighetsgrad.

Det er derfor relevant å studere dereguleringen av nøytrofiler gjennom hele livssyklusen deres: deres oksidative utbrudd under aktivering, deres fysiologiske apoptose, uttrykket til PR3-partnere. Denne studien vil bli utført på nøytrofiler fra pasienter med GPA sammenlignet med alders- og kjønnsjusterte friske kontroller.

C. Foreløpige studier Analyse av apoptose hos nøytrofiler fra GPA-pasienter I litteraturen ble nøytrofiler fra pasienter med ANCA-assosiert vaskulitt (AAV) funnet å ha en forstyrret TNFα-indusert apoptose og har en tendens til å ha en høyere apoptoserate enn kontroller. Imidlertid er publiserte data om fysiologisk apoptose, som er den spontane apoptosen som nøytrofiler gjennomgår i fravær av eksogene stimuli, motstridende. Når kalvefosterserum tilsettes i medium, viser nøytrofiler fra GPA-pasienter en lignende apoptoserate enn kontroller. Når serum fra pasienter brukes, har nøytrofiler fra AAV-pasienter i remisjon høyere overlevelse in vivo enn kontroller, og denne forskjellen forsvinner når normalt serum brukes. Disse resultatene er i samsvar med oppdagelsen av at GPA-pasienter har et høyt uttrykk for PCNA som er assosiert med overlevelse. Derfor ønsker vi å studere apoptosefrekvensen til nøytrofiler i GPA ved diagnose, under tilbakefall og etter remisjon på fullblod. Disse resultatene vil bli sammenlignet med alders- og kjønnsmatchede kontroller. Apoptose vil bli evaluert ved fosfatidylserin-eksternisering målt ved flowcytometri etter annexin-V-merking og 7-AAD-farging på CD15+-celler. PCNA-ekspresjon vil også bli undersøkt på det forskjellige kliniske stadiet og proteomisk profil av apoptotiske nøytrofiler vil bli utført.

Analyse av scramblase/calreticulin-ekspresjon i nøytrofiler fra GPA-pasienter I en cellulær modell (RBL-cellelinje) har vi vist at scramblase-utryddelse av shRNA var assosiert med redusert ekspresjon av fosfatidylserin under apoptose og at PR3-apoptose-indusert uttrykk også ble svekket (upublisert) data). Vi var også i stand til å demonstrere at in vitro scramblase og PR3 samhandler fysisk. Under apoptose er PR3 også assosiert med kalretikulin ved membranen til nøytrofiler. Disse dataene antyder at assosiasjonen PR3/Scramblase/Calreticulin danner et molekylært stillas som er en funksjonell plattform som kan forstyrre gjenkjenningsveier (som CRT/LRP) mellom makrofager og apoptotiske nøytrofiler. Ekspresjonen til disse partnerne ved den nøytrofile membranen under apoptose vil bli undersøkt hos pasienter ved diagnose og når remisjon oppnås.

Forskningsdesign og metoder:

1. Karakterisering av apoptose hos nøytrofiler fra GPA-pasienter Vi vil bestemme apoptoserate for nøytrofiler i fullblod.

   Metodikk:

   Forskning vil bli utført både på nøytrofiler isolert fra friske kontrolldonorer oppnådd ved det franske blodinstituttet (Etablissement Français du Sang) og fra vaskulittpasienter fra Institutt for indremedisin ved Cochin Hospital ledet av professor Loïc Guillevin.

   Apoptose vil bli indusert "fysiologisk" i fullblod ved inkubering over natten ved 37°C.

   Eksternalisering av fosfatidylserin vil bli målt ved flowcytometri etter annexin-V-merking assosiert med 7-AAD-farging for CD15+-celler.

   Western blot-analyse ved bruk av et spesifikt antistoff mot PCNA vil også bli brukt for å visualisere uttrykket.

2. Analyse av scramblase, PR3, calreticulin, AnnexinA1, ekspresjon i apoptotiske nøytrofiler fra GPA-pasienter Vi vil bestemme membranekspresjonen av PR3, CRT, PLSCR, AxA1, i apoptotiske nøytrofiler i de forskjellige undergruppene av nøytrofiler: ikke-apoptotiske (AnnexinV-, AnnexAAD) -), tidlige apoptotiske nøytrofiler (AnnexinV+, 7AAD-) og sene apoptotiske nøytrofiler (AnnexinV+, 7AAD+). Denne bestemmelsen vil bli gjort for pasienter ved diagnosetidspunktet (i aktiv tilstand; BVAS>3) og ved remisjon.

   Metodikk

   • Nøytrofiler vil bli isolert fra blod ved hjelp av Dextran gradient og Ficoll.
   • Undersøkelse av PR3, CRT, PLSCR, AxA1, membranekspresjon vil bli målt på isolerte nøytrofiler ved flowcytometri etter inkubering over natten ved 37°C med vurdering av apoptose ved annexin-V-merking og 7AAD-farging.

3. Studie av respirasjonsutbruddet i nøytrofiler hos GPA-pasienter En av hovedfunksjonene til nøytrofiler er produksjonen av reaktive oksygenarter, vi vil bestemme den oksidative metabolismen til nøytrofiler på grunn av forskjellige stimuli (f-MLP, opsoniserte zymosan-perler ved komplement, opsoniserte zymosan perler av IgG, PMA) med eller uten en tidligere priming med TNFα.

   Metodikk:

   Utforskning av respirasjonsutbruddet vil bli gjort i fullblod med en kjemoluminescerende (luminol) teknikk. Nøytrofiler vil bli primet av TNFα eller stimulert uten priming. Burst-responsen vil bli analysert i løpet av 90 minutter etter stimulering.

4. Deregulering av nøytrofile cytokinomnøytrofiler er i stand til å syntetisere et stort antall cytokiner (IL-1, TNFα, IL-6, IL-12), vekstfaktorer som GM-CSF og chimiokiner som IL-8. Nylig har det blitt vist at nøytrofiler også er gode produsenter av BAFF (B-celleaktiverende faktor) og at produksjonen er overlegen fra monocytter eller dendrittiske celler når de stimuleres av INF-γ. I GPA-serum har BAFF-nivåer vist seg å være høyere enn kontrollene, og nylig rettet mot B-lymfocytter har terapeutika bekreftet i store kontrollerte studier deres betydning i AAV.

   Metodikk:

   Serum fra pasienter vil bli samlet inn samtidig enn nøytrofiler. De vil bli analysert ved hjelp av BD™ Cytometric Bead Array (CBA) med deteksjon av IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF og IL-12p70. Nøytrofiler som vil bli isolert som i 1) vil bli stimulert av INF-y, LPS og G-CSF for å analysere deres produksjon og sekresjon av BAFF/BlyS bestemt ved ELISA.

5. Deregulering av nøytrofile proteomer og funksjonell studie av nye PR3-partnere Genarray-studier har vist en sannsynlig deregulering av nøytrofiler i AAV, i denne studien vil vi studere denne dereguleringen på proteinnivå.

Metodikk:

For å studere proteomet til GPA-pasienten når den er aktiv og i remisjon sammenlignet med friske kontroller, vil vi bruke en differensial i gelelektroforese av cytosoliske prøver av nøytrofiler oppnådd ved sonikering. Identifikasjon av proteiner av interesse vil bli gjort ved massespektrometri MALDI-TOF-TOF. Funksjonell validering av disse proteinene ved overekspresjon eller siRNA-utryddelse vil bli utført.