Neutrofiilit prognostisina tekijöinä granulomatoosissa polyangiitin kanssa (aiemmin nimeltään Wegenerin granulomatoosi) (NeutroVasc)

A - Erityistavoitteet Yleinen tavoite: Tämä projekti on suunniteltu tutkimaan GPA:han solu- ja molekyylitasolla liittyviä fysiopatologisia mekanismeja. tutkijat haluavat tutkia neutrofiilejä prognostisina tekijöinä ja määrittää PR3:n, tärkeimmän autoantigeenin vaikutuksen tulehduksen ratkaisuvaiheessa.

tutkijoiden työhypoteesi on, että PR3:n rakenteellinen ja toiminnallinen analyysi neutrofiileissä auttaa tutkijoita purkamaan sen roolia GPA:ssa. Siksi pitkän aikavälin tavoitteemme on ymmärtää paremmin mekanismeja, jotka liittyvät PR3:n ilmentymisen modulaatioon neutrofiilien kalvolla, jotta voidaan estää niiden aktivaatio ja ehdottaa uusia anti-inflammatorisia terapeuttisia strategioita, jotka on mukautettu GPA:han.

Nykyinen projekti: Tutkijat osoittivat äskettäin, että ihmisen neutrofiileissä i) PR3 voi ilmentyä neutrofiilien kalvolla apoptoosin aikana ilman degranulaatiota, ii) PR3 on molekyylirunkorakenteen jäsen, joka sisältää fosfolipidiskramblaasin1 (skramblaasin) ja ulkoisen kalretikulaalin , iii) apoptoosin aiheuttama PR3-kalvon ilmentyminen heikentää makrofagien uudelleenohjelmointia apoptoottisten neutrofiilien fagosytoosin jälkeen. Tutkijoiden hypoteesi on, että PR3:lla saattaa olla spesifisiä molekyylikumppaneita, jotka voivat helpottaa sen ulkoistumista ja/tai sen pysymistä plasmakalvolla neutrofiilien apoptoosin aikana, mikä voimistaa sen automaattista apoptoosia. - antigeeninen kapasiteetti.

Erityistavoitteet ovat:

1. Apoptoosin karakterisointi GPA-potilaiden neutrofiileissä
2. PR3-partnereiden (CD16, CD11b, kalretikuliini, fosfolipidikramblaasi1) tai tulehduksissa kiinnostavan proteiinin (AnnexinA1) ilmentymisen analyysi GPA-potilaiden neutrofiileissä verrattuna terveisiin kontrolleihin
3. PR3:n uusien kumppanien tunnistaminen neutrofiileissä
4. GPA-potilaiden neutrofiilien proteomin analyysi

B. Tausta ja merkitys 1.1. Johdanto GPA on systeeminen vaskuliitti, joka liittyy pääasiassa anti-PR3 ANCA:han. Aktivoituneiden neutrofiilien roolista vaskuliittileesioissa viittaa niiden läsnäolo perivaskulaarisissa infiltraateissa, erityisesti munuaiskeräsissä ja keuhkoissa.

PR3 on seriiniproteaasi, joka kuvattiin ensin neutrofiilien atsurofiilisissä rakeissa, joiden EI ole tarkoitus fuusioitua plasmakalvon kanssa, mutta jotka vapautuvat fagolysosomissa patogeenin fagosytoosin jälkeen. Olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että PR3:n subsellulaarinen lokalisointi ei rajoittunut atsurofiilisiin rakeisiin, kuten aiemmin ajateltiin, vaan että PR3 oli lokalisoitunut erittyviin rakkuloihin, erittäin mobilisoituvaan osastoon, mikä selittää PR3:n läsnäolon lepotilan pinnalla eristettynä. neutrofiilit. Lisäksi vaskuliittipotilailla havaittu PR3:a ilmentävien neutrofiilien korkea prosenttiosuus voidaan pitää vaskuliitin riskitekijänä. Tämä kalvon PR3:n korkea ilmentyminen potilailla, joilla oli GPA, johti ANCA-indusoidun hengityspurskeen lisääntymiseen neutrofiileissä, mikä tehosti tulehdusprosessia. In vitro ANCA:n sitoutuminen PR3:een laukaisee hengityspurskeen, degranulaation ja tulehdusta edistävien sytokiinien vapautumisen.

Koska PR3-kalvon ilmentyminen on tärkeä patofysiologinen tapahtuma GPA:ssa, koska se on edellytys ANCA:n myöhemmälle neutrofiilien aktivaatiolle, pyrimme määrittämään PR3-kalvon ilmentymiseen liittyvät mekanismit. Neutrofiileissä osoitimme, että apoptoosi laukaisi merkittävästi lisääntyneen kalvon PR3-ekspression ilman degranulaatiota. Näissä kokeissa emme onnistuneet havaitsemaan MPO:ta neutrofiilien kalvolla. Tuloksemme eroavat aiemmin raportoiduista tiedoista, jotka osoittavat, että sekä MPO että PR3 ulkoistettiin apoptoosin aikana, koska atsurofiiliset rakeet siirtyivät plasmakalvoon. Tämä ilmiö näyttää tapahtuvan, kun neutrofiilit käyvät läpi myöhäisen apoptoosin ja sekundaarisen nekroosin, mikä johtaa kaikkien raeproteiinien ilmentymiseen solun pinnalla.

Apoptoosin aiheuttamalla PR3:n ulkoistumisella voi olla suuri merkitys GPA:n patofysiologiassa, koska PR3, jonka oletettiin olevan solunsisäinen antigeeni, altistuu siten apoptoottisten solujen plasmakalvolle, mikä vahvistaa sen tulehdusta edistävää potentiaalia, sen immunogeenisiä ominaisuuksia ja häiritsee. makrofagifagosytoosin kanssa. Olemme myös osoittaneet, että apoptoosin aikana PR3:n ilmentyminen liittyy kalretikuliinin ekspressioon, joka on hyvin tunnettu "syö minut -signaali". Olemme vihdoin osoittaneet, että PR3:n läsnäolo heikentää makrofagien uudelleenohjelmointia tulehdusta estäväksi profiiliksi apoptoottisten solujen fagosytoosin jälkeen CRT/LRP-reitin kautta.

Voidaan olettaa, että kompleksin PR3/skramblaasi/CRT ja muiden kumppaneiden (CD11b, CD16) ilmentyminen apoptoottisten neutrofiilien pinnalla voisi muodostaa hyviä ennustemarkkereita. Geenisarjatutkimukset ovat osoittaneet neutrofiilien deregulaatiota GPA:ssa. Teemme hypoteesin, että GPA-potilaiden neutrofiilien proteomi olisi erittäin informatiivinen sen aktivaatiotilasta, eloonjäämistilasta ja että se voisi olla kliinisen vakavuuden biologinen merkki.

Siksi on aiheellista tutkia neutrofiilien säätelyn purkamista niiden koko elinkaaren aikana: niiden oksidatiivista purkausta aktivaation aikana, niiden fysiologista apoptoosia, PR3-partnerien ilmentymistä. Tämä tutkimus suoritetaan GPA-potilaiden neutrofiileillä verrattuna ikään ja sukupuoleen mukautettuihin terveisiin kontrolleihin.

C. Alustavat tutkimukset GPA-potilaiden neutrofiilien apoptoosin analyysi Kirjallisuudessa ANCA-assosioitunutta vaskuliittia (AAV) sairastavien potilaiden neutrofiileillä havaittiin häiriintynyt TNFa-indusoitu apoptoosi ja niillä on taipumus olla suurempi apoptoosin nopeus kuin kontrolleilla. Kuitenkin julkaistut tiedot fysiologisesta apoptoosista, joka on spontaani apoptoosi, jonka neutrofiilit käyvät läpi eksogeenisten ärsykkeiden puuttuessa, ovat ristiriitaisia. Kun vasikan sikiön seerumia lisätään elatusaineeseen, GPA-potilaiden neutrofiilit osoittavat samanlaista apoptoosia kuin kontrollit. Kun potilaiden seerumia käytetään, remissiossa olevien AAV-potilaiden neutrofiileillä on korkeampi eloonjäämisaste in vivo kuin kontrolleilla, ja tämä ero häviää käytettäessä normaalia seerumia. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä sen havainnon kanssa, että GPA-potilailla on korkea PCNA:n ilmentyminen, mikä liittyy eloonjäämiseen. Siksi haluamme tutkia neutrofiilien apoptoosinopeutta GPA:ssa diagnoosin yhteydessä, relapsin aikana ja remission jälkeen kokoverestä. Näitä tuloksia verrataan ikää ja sukupuolta vastaaviin kontrolleihin. Apoptoosi arvioidaan fosfatidyyliseriinin ulkoistumisen avulla, joka mitataan virtaussytometrialla anneksiini-V-leimauksen ja 7-AAD-värjäyksen jälkeen CD15+-soluissa. PCNA:n ilmentymistä tutkitaan myös eri kliinisissä vaiheissa ja apoptoottisten neutrofiilien proteominen profiili suoritetaan.

Skramblaasin/kalretikuliinin ilmentymisen analyysi GPA-potilaiden neutrofiileissä Solumallissa (RBL-solulinja) olemme osoittaneet, että shRNA:n aiheuttama scramblaasin ekstinktio liittyi fosfatidyyliseriinin vähentyneeseen ilmentymiseen apoptoosin aikana ja että PR3-apoptoosin aiheuttama ilmentyminen oli myös heikentynyt (julkaisematon). tiedot). Pystyimme myös osoittamaan, että in vitro scramblaasi ja PR3 ovat fyysisesti vuorovaikutuksessa. Apoptoosin aikana PR3 liittyy myös kalretikuliiniin neutrofiilien kalvossa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että PR3/Scramblase/Calreticulin-assosiaatio muodostaa molekyylirungon, joka on toiminnallinen alusta, joka voi häiritä tunnistusreittejä (kuten CRT/LRP) makrofagien ja apoptoottisten neutrofiilien välillä. Näiden kumppanien ilmentyminen neutrofiilien kalvolla apoptoosin aikana tutkitaan potilailla diagnoosin yhteydessä ja kun remissio saavutetaan.

Tutkimussuunnittelu ja menetelmät:

1. GPA-potilaiden neutrofiilien apoptoosin karakterisointi Määritämme neutrofiilien apoptoosinopeuden kokoverestä.

   Metodologia:

   Tutkimuksia tehdään sekä terveiltä kontrolliluovuttajilta eristetyillä neutrofiileillä, jotka on saatu Ranskan veriinstituutista (Etablissement Français du Sang), että vaskuliittipotilailta Cochinin sairaalan sisätautien osastolta, jota johtaa professori Loïc Guillevin.

   Apoptoosi indusoidaan "fysiologisesti" kokoveressä inkuboimalla yön yli 37 °C:ssa.

   Fosfatidyyliseriinin ulkoistumista mitataan virtaussytometrialla anneksiini-V-leimauksen jälkeen, joka liittyy CD15+-solujen 7-AAD-värjäytymiseen.

   Western blot -analyysiä, jossa käytetään spesifistä vasta-ainetta PCNA:ta vastaan, käytetään myös sen ilmentymisen visualisoimiseen.

2. Skramblaasin, PR3:n, kalretikuliinin, AnnexinA1:n, ilmentymisen analyysi GPA-potilaiden apoptoottisissa neutrofiileissä Määritämme PR3:n, CRT:n, PLSCR:n, AxA1:n kalvoekspression apoptoottisissa neutrofiileissä neutrofiilien eri alaryhmissä: ei-apoptoottisissa (AnnexinAADV-, -), varhaiset apoptoottiset neutrofiilit (AnnexinV+, 7AAD-) ja myöhäiset apoptoottiset neutrofiilit (AnnexinV+, 7AAD+). Tämä määritys tehdään potilaille diagnoosin ajankohtana (aktiivisessa tilassa; BVAS>3) ja remissiossa.

   Metodologia

   • Neutrofiilit eristetään verestä käyttämällä dekstraanigradienttia ja Ficollia.
   • PR3:n, CRT:n, PLSCR:n, AxA1:n ja kalvoekspression tutkiminen mitataan eristetyistä neutrofiileistä virtaussytometrialla yön yli 37 °C:ssa inkuboinnin jälkeen ja apoptoosin arviointi anneksiini-V-leimauksella ja 7AAD-värjäyksellä.

3. GPA-potilaiden neutrofiilien hengityspurskeen tutkimus Yksi neutrofiilien päätehtävistä on reaktiivisten happilajien tuotanto, määritämme neutrofiilien oksidatiivisen aineenvaihdunnan erilaisista ärsykkeistä (f-MLP, opsonoidut tsymosaanihelmet komplementilla, opsonoitu tsymosaani) helmiä IgG:llä, PMA:lla) joko aikaisemmalla TNFa-pohjustuksella tai ilman sitä.

   Metodologia:

   Hengityspurskeen tutkiminen tehdään kokoveressä kemoluminesenssitekniikalla (luminoli). Neutrofiilit valmistetaan TNFa:lla tai niitä stimuloidaan ilman esikäsittelyä. Purskevastetta analysoidaan 90 minuutin ajan stimulaation jälkeen.

4. Neutrofiilien sytokinomin säätelyn purkaminen Neutrofiilit kykenevät syntetisoimaan suuren määrän sytokiinejä (IL-1, TNFa, IL-6, IL-12), kasvutekijöitä, kuten GM-CSF, ja kimiokiineja, kuten IL-8. Äskettäin on osoitettu, että neutrofiilit ovat myös suuria BAFF:n (B-solua aktivoivan tekijän) tuottajia ja että tuotanto on parempi kuin monosyyttien tai dendriittisolujen tuottamat, kun niitä stimuloidaan INF-y:lla. GPA:ssa seerumin BAFF-tasojen on osoitettu olevan korkeampia kuin kontrolleissa, ja äskettäin B-lymfosyyteihin kohdistetut lääkkeet ovat vahvistaneet laajoissa kontrolloiduissa tutkimuksissa niiden merkityksen AAV:ssa.

   Metodologia:

   Potilaiden seerumi kerätään samaan aikaan kuin neutrofiilit. Ne analysoidaan käyttämällä BD™ Cytometric Bead Array (CBA) -sytometristä helmijärjestelmää, jossa havaitaan IL-8, IL-1p, IL-6, IL-10, TNF ja IL-12p70. Neutrofiilit, jotka eristetään kuten kohdassa 1), stimuloidaan INF-y:lla, LPS:llä ja G-CSF:llä analysoimaan niiden tuotantoa ja BAFF/BlyS:n eritystä ELISA:lla määritettynä.

5. Neutrofiilien deregulaatio Proteomi ja uusien PR3-kumppaneiden toiminnallinen tutkimus Geeniryhmätutkimukset ovat osoittaneet neutrofiilien todennäköisen deregulaation AAV:ssa, tässä tutkimuksessa tutkimme tätä deregulaatiota proteiinitasolla.

Metodologia:

Tutkiaksemme GPA-potilaan proteomia aktiivisena ja remissiossa terveisiin kontrolleihin verrattuna käytämme sonikaatiolla saatujen neutrofiilien sytosolisten näytteiden geelielektroforeesin erotusta. Kiinnostavat proteiinit identifioidaan massaspektrometrialla MALDI-TOF-TOF. Näiden proteiinien toiminnallinen validointi suoritetaan yli-ilmentymällä tai siRNA-ekstinktiolla.