Neutrófilos como factores pronósticos en la granulomatosis con poliangeítis (anteriormente denominada granulomatosis de Wegener) (NeutroVasc)

A - Objetivos Específicos Objetivo general: Este proyecto está diseñado para estudiar los mecanismos fisiopatológicos implicados en la GPA a nivel celular y molecular. los investigadores quieren estudiar los neutrófilos como factores pronósticos y determinar la implicación de PR3, el principal autoantígeno en la fase de resolución de la inflamación.

la hipótesis de trabajo de los investigadores es que el análisis estructural y funcional de PR3 en los neutrófilos ayudará a los investigadores a desentrañar su papel en la GPA. Por lo tanto, nuestro objetivo a largo plazo es comprender mejor los mecanismos involucrados en la modulación de la expresión de PR3 en la membrana de los neutrófilos para inhibir su activación y proponer nuevas estrategias terapéuticas antiinflamatorias adaptadas a GPA.

Proyecto actual: Los investigadores demostraron recientemente que en los neutrófilos humanos i) PR3 se puede expresar en la membrana de los neutrófilos durante la apoptosis en ausencia de desgranulación, ii) PR3 es un miembro de un andamiaje molecular que comprende fosfolípidoscramblase1 (scramblase) y calreticulina externalizados durante la apoptosis , iii) la expresión de membrana de PR3 inducida por apoptosis afecta la reprogramación de macrófagos después de la fagocitosis de neutrófilos apoptóticos. -capacidad antigénica.

Los objetivos específicos son:

1. Caracterización de la apoptosis en neutrófilos de pacientes con GPA
2. Análisis de la expresión de los socios PR3 (CD16, CD11b, Calreticulina, Fosfolípidoscramblasa1) o de la proteína de interés en la inflamación (Anexina A1) coexpresada en neutrófilos de pacientes con GPA en comparación con controles sanos
3. Identificación de nuevos socios de PR3 en neutrófilos
4. Análisis del proteoma de neutrófilos de pacientes con GPA

B. Antecedentes y significado 1.1. Introducción La GPA es una vasculitis sistémica que se asocia principalmente a ANCA anti-PR3. El papel de los neutrófilos activados en las lesiones de vasculitis se sugiere por su presencia en los infiltrados perivasculares, especialmente en los glomérulos renales y en el pulmón.

PR3 es una serina proteasa descrita por primera vez dentro de los gránulos azurofílicos de los neutrófilos que se supone que NO se fusionan con la membrana plasmática, sino que se liberan dentro del fagolisosoma después de la fagocitosis del patógeno. Hemos demostrado por primera vez que la localización subcelular de PR3 no estaba restringida a gránulos azurofílicos, como se pensaba anteriormente, sino que PR3 estaba localizado en vesículas secretoras, un compartimento altamente movilizable, lo que explica la presencia de PR3 en la superficie de reposo aislado. neutrófilos. Además, un alto porcentaje de neutrófilos que expresan PR3 observado en pacientes con vasculitis podría considerarse un factor de riesgo de vasculitis. Esta alta expresión de PR3 de membrana en pacientes con GPA dio como resultado un aumento en el estallido respiratorio inducido por ANCA en los neutrófilos, lo que mejoró el proceso inflamatorio. In vitro, la unión de ANCA a PR3 desencadena el estallido respiratorio, la desgranulación y la liberación de citocinas proinflamatorias.

Debido a que la expresión de membrana de PR3 es un evento fisiopatológico importante en GPA, ya que es un requisito previo para la activación posterior de los neutrófilos por ANCA, buscamos determinar los mecanismos involucrados en la expresión de membrana de PR3. En los neutrófilos, demostramos que la apoptosis desencadenó un aumento significativo de la expresión de PR3 en la membrana sin desgranulación. En estos experimentos, fallamos en detectar MPO en la membrana de los neutrófilos. Nuestros resultados difieren de los datos informados anteriormente que muestran que tanto MPO como PR3 se externalizaron durante la apoptosis debido a la translocación de gránulos azurofílicos a la membrana plasmática. Este fenómeno parece ocurrir cuando los neutrófilos experimentan apoptosis tardía y necrosis secundaria, lo que conduce a la expresión de todas las proteínas granulares en la superficie celular.

La externalización de PR3 inducida por apoptosis podría ser de gran relevancia en la fisiopatología de la GPA porque PR3, que se suponía que era un antígeno intracelular, queda así expuesto en la membrana plasmática de las células apoptóticas, amplificando así su potencial proinflamatorio, sus propiedades inmunogénicas e interfiriendo con fagocitosis de macrófagos. También hemos demostrado que durante la apoptosis la expresión de PR3 está asociada con la expresión de calreticulina, una conocida "señal de comer". Finalmente hemos evidenciado que la presencia de PR3 perjudica la reprogramación de macrófagos a un perfil antiinflamatorio después de la fagocitosis de células apoptóticas a través de la vía CRT/LRP.

Se puede plantear la hipótesis de que la expresión del complejo PR3/scramblase/CRT y otros asociados (CD11b, CD16) en la superficie de los neutrófilos apoptóticos podría constituir buenos marcadores de pronóstico. Los estudios de matriz de genes han señalado una desregulación de los neutrófilos en GPA. Hacemos la hipótesis de que el proteoma de neutrófilos de pacientes con GPA sería muy informativo de su estado de activación, estado de supervivencia y que podría ser un marcador biológico de gravedad clínica.

Por lo tanto, es pertinente estudiar la desregulación de los neutrófilos durante todo su ciclo de vida: su explosión oxidativa bajo activación, su apoptosis fisiológica, la expresión de los compañeros PR3. Este estudio se realizará en neutrófilos de pacientes con GPA en comparación con controles sanos ajustados por edad y sexo.

C. Estudios preliminares Análisis de la apoptosis en neutrófilos de pacientes con GPA En la literatura, se encontró que los neutrófilos de pacientes con vasculitis asociada a ANCA (VAA) tenían una apoptosis inducida por TNFα alterada y tiende a tener una tasa de apoptosis más alta que los controles. Sin embargo, los datos publicados sobre la apoptosis fisiológica, que es la apoptosis espontánea que experimentan los neutrófilos en ausencia de estímulos exógenos, son contradictorios. Cuando se añade suero fetal de ternera al medio, los neutrófilos de pacientes con GPA muestran una tasa de apoptosis similar a la de los controles. Cuando se utiliza suero de pacientes, los neutrófilos de pacientes con VAA en remisión tienen una tasa de supervivencia in vivo mayor que los controles, y esta diferencia desaparece cuando se utiliza suero normal. Estos resultados están de acuerdo con el descubrimiento de que los pacientes con GPA tienen una alta expresión de PCNA que se asocia con la supervivencia. Por lo tanto, queremos estudiar la tasa de apoptosis de los neutrófilos en GPA en el momento del diagnóstico, durante la recaída y después de la remisión en sangre total. Estos resultados se compararán con controles emparejados por edad y sexo. La apoptosis se evaluará mediante la externalización de fosfatidilserina medida por citometría de flujo después del marcaje con anexina-V y la tinción con 7-AAD en células CD15+. También se investigará la expresión de PCNA en las diferentes etapas clínicas y se realizará el perfil proteómico de los neutrófilos apoptóticos.

Análisis de la expresión de scramblase/calreticulina en neutrófilos de pacientes con GPA En un modelo celular (línea celular RBL), hemos demostrado que la extinción de scramblase por shRNA se asoció con una disminución de la expresión de fosfatidilserina durante la apoptosis y que la expresión inducida por la apoptosis de PR3 también se vio afectada (no publicado). datos). También pudimos demostrar que la scramblasa in vitro y PR3 interactúan físicamente. Durante la apoptosis, PR3 también se asocia con calreticulina en la membrana de los neutrófilos. Estos datos sugieren que la asociación PR3/Scramblase/Calreticulina forma un andamio molecular que es una plataforma funcional que podría interferir con las vías de reconocimiento (como CRT/LRP) entre macrófagos y neutrófilos apoptóticos. La expresión de estas parejas en la membrana de los neutrófilos durante la apoptosis se investigará en pacientes en el momento del diagnóstico y cuando se obtenga la remisión.

Diseño y métodos de investigación:

1. Caracterización de la apoptosis en neutrófilos de pacientes con GPA Determinaremos la tasa de apoptosis de neutrófilos en sangre entera.

   Metodología:

   La investigación se realizará tanto en neutrófilos aislados de donantes de control sanos obtenidos en el Instituto Francés de la Sangre (Etablissement Français du Sang) como de pacientes con vasculitis del Departamento de Medicina Interna del Hospital Cochin dirigido por el profesor Loïc Guillevin.

   La apoptosis se inducirá "fisiológicamente" en sangre completa mediante incubación durante la noche a 37°C.

   La externalización de fosfatidilserina se medirá mediante citometría de flujo después del marcaje con anexina-V asociado con la tinción con 7-AAD para células CD15+.

   También se utilizará el análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo específico contra PCNA para visualizar su expresión.

2. Análisis de la expresión de scramblase, PR3, calreticulina, Anexina A1, en neutrófilos apoptóticos de pacientes con GPA Determinaremos la expresión de membrana de PR3, CRT, PLSCR, AxA1, en neutrófilos apoptóticos en los diferentes subconjuntos de neutrófilos: no apoptóticos (Anexina V-, 7AAD -), neutrófilos apoptóticos tempranos (AnnexinV+, 7AAD-) y neutrófilos apoptóticos tardíos (AnnexinV+, 7AAD+). Esta determinación se realizará para pacientes en el momento del diagnóstico (en estado activo; BVAS>3) y en remisión.

   Metodología

   • Los neutrófilos se aislarán de la sangre utilizando gradiente de dextrano y Ficoll.
   • La investigación de PR3, CRT, PLSCR, AxA1, la expresión de la membrana se medirá en neutrófilos aislados mediante citometría de flujo después de una incubación durante la noche a 37 °C con evaluación de la apoptosis mediante marcaje con anexina-V y tinción con 7AAD.

3. Estudio del estallido respiratorio en neutrófilos de pacientes con GPA Una de las principales funciones de los neutrófilos es la producción de especies reactivas de oxígeno, determinaremos el metabolismo oxidativo de los neutrófilos debido a diferentes estímulos (f-MLP, perlas de zimosano opsonizado por complemento, zimosano opsonizado perlas por IgG, PMA) con o sin cebado previo por TNFα.

   Metodología:

   La exploración del estallido respiratorio se realizará en sangre entera con técnica quimioluminiscente (luminol). Los neutrófilos serán cebados por TNFα o estimulados sin cebado. La respuesta de ráfaga se analizará durante 90 minutos después de la estimulación.

4. Desregulación del citoquinoma de neutrófilos Los neutrófilos son capaces de sintetizar un gran número de citocinas (IL-1, TNFα, IL-6, IL-12), factores de crecimiento como GM-CSF y quimiocinas como IL-8. Más recientemente se ha demostrado que los neutrófilos también son grandes productores de BAFF (factor activador de células B) y que su producción es superior a la de los monocitos o las células dendríticas cuando son estimulados por INF-γ. En GPA, se ha demostrado que los niveles séricos de BAFF son más altos que los controles y, recientemente, las terapias dirigidas a los linfocitos B han confirmado en grandes ensayos controlados su importancia en AAV.

   Metodología:

   El suero de los pacientes se recogerá al mismo tiempo que los neutrófilos. Se analizarán utilizando BD™ Cytometric Bead Array (CBA) con detección de IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF e IL-12p70. Los neutrófilos que serán aislados como en 1) serán estimulados por INF-γ, LPS y G-CSF para analizar su producción y secreción de BAFF/BlyS determinada por ELISA.

5. Desregulación del proteoma de neutrófilos y estudio funcional de nuevos socios de PR3 Los estudios de matriz de genes han mostrado una probable desregulación de neutrófilos en AAV, en este estudio estudiaremos esta desregulación a nivel de proteína.

Metodología:

Para estudiar el proteoma del paciente GPA cuando está activo y en remisión en comparación con los controles sanos, utilizaremos una electroforesis diferencial en gel de muestras citosólicas de neutrófilos obtenidas por sonicación. La identificación de proteínas de interés se realizará mediante espectrometría de masas MALDI-TOF-TOF. Se realizará la validación funcional de estas proteínas por sobreexpresión o extinción de siRNA.